Mitochondrial dysfunction as a source for misleading positives in in vitro DNA damage assays
Loading...
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Unless otherwise stated, all rights belong to the author. You may download, display and print this publication for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Authors
Date
2018-08-20
Department
Major/Subject
Biosystems and Biomaterials Engineering
Mcode
CHEM3028
Degree programme
Master’s Programme in Life Science Technologies
Language
en
Pages
85+13
Series
Abstract
Drug toxicity testing is a necessary part of the drug development process and it is required by the regulatory authorities. Genotoxicity, the ability of drugs to cause DNA damage, is tested by both in vivo and in vitro tests. In vitro DNA damage assays have high sensitivity but low specificity and hence they cause misleading positive results, which leads to unnecessary animal testing. Animal testing is expensive and causes ethical issues. Drugs that cause dysfunction in mitochondria are called mitochondrial toxins. Since the majority of the ATP is produced in mitochondria, mitochondrial toxins may cause insufficient energy production in mammalian cells. Since many processes in the cell, such as the cell cycle regulation, DNA damage repair and cytoskeleton dynamics, are energy dependent, the ATP depletion could possibly lead to indirect DNA damage response. The aim of this study was to investigate if the ATP depletion caused by the mitochondrial toxins induces the DNA damage indirectly and hence lead to misleading positive results in genotoxic assays. The focus was on examining whether the ATP depletion would cause DNA damage via changed dynamics of cytoskeleton. The study was conducted with High-content analysis (HCA). HepG2/C3A cells were treated with 16 compounds, 15 mitochondrial toxins and one genotoxic agent, paclitaxel. The cells were immunolabeled to detect tubulin and actin fibers, nuclei, DNA double strand breaks and mitotic cells. Excluding metformin, all of the mitochondrial toxins did increase the DNA damage response significantly (p<0.05) in HepG2/C3A cells. Most of these compounds seemed to increase the DNA damage due to the cell death. However, most of the compounds that interfere with ATP production via uncoupling, increased DNA damage response without the cell death. Paclitaxel was the only compound that increased both the DNA double strand break marker and the mitotic marker simultaneously. Since the DNA damage marker and mitosis marker had a negative correlation it can be concluded that energy depletion did not cause dysfunction in the cell cycle regulation. Paclitaxel and most of the mitochondrial toxins seemed to affect the tubulin and actin dynamics. There appeared to be association between DNA damage and changed cytoskeleton dynamics but the causality of the two was not verified and requires further investigation. Whether the responses were due to the ATP depletion or general cytotoxicity of the mitochondrial toxins, was not confirmed in this study.Lääkkeiden toksisuuden testaaminen on oleellinen osa lääkekehityskaarta ja lääkevalvontaviranomaiset velvoittavat sitä myyntilupaa hakevilta valmisteilta. Lääkkeet, jotka aiheuttavat vaurioita suoraan DNA:han, ovat genotoksisia. Genotoksisuutta tutkitaan niin in vivo- kuin in vitro -menetelmillä. DNA-vaurioiden tutkimista varten kehitellyt in vitro –testit ovat herkkiä, mutta epäspesifisiä, mistä johtuen ne antavat harhaanjohtavia positiivisia tuloksia. Tämä johtaa turhiin eläinkokeisiin, jotka ovat kalliita ja herättävät eettisiä kysymyksiä. Mitokondrioihin vaikuttavat toksiinit aiheuttavat mitokondrioiden vajaatoimintaa ja koska suurin osa nisäkässolujen ATP-tuotannosta tapahtuu niissä, voi solujen altistuminen näille toksiineille johtaa riittämättömään energiatuotantoon. Monet solussa tapahtuvat prosessit, kuten solusyklin sääntely, DNA:n korjausmekanismit ja solutukirankadynamiikka, ovat energiariippuvaisia. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, voiko mitokondriotoksisuudesta johtuva energiavaje johtaa epäsuorasti DNA-vaurioihin ja aiheuttaa siten harhaanjohtavia positiivisia tuloksia genotoksisuustesteissä. Työssä keskityttiin tutkimaan, aiheuttiko ATP:n puutos DNA-vaurioita nimenomaan muuttuneen solutukirankadynamiikan vuoksi. Tämä tutkimus suoritettiin High-content analysis (HCA) –metodilla. HepG2/C3A-solut käsiteltiin 16:lla aineella, joista 15 oli mitokondriotoksisia ja yksi, paklitakseli, genotoksinen. Soluille suoritettiin vasta-ainevärjäys, jolla paikallistettiin solujen tumat, mikrotubulukset, aktiinisäikeet, DNA-katkokset ja mitoottiset solut. Metformiinia lukuun ottamatta kaikki mitokondriotoksiinit lisäsivät DNA-katkosten määrää merkitsevästi (p<0.05) HepG2/C3A-soluilla. Suurella osalla näistä toksiineista DNA-katkosten lisääntyminen näytti johtuvan solukuolemasta. Aineet, jotka aiheuttivat ATP:n puutosta irtikytkennästä johtuen, lisäsivät DNA-katkosten määrää, vaikka solukuolemien määrä ei lisääntynyt. Paklitakseli oli ainoa aine, joka lisäsi sekä DNA-katkosten että mitoottisten solujen osuutta samanaikaisesti. Muilla aineilla DNA-katkosten ja mitoottisten solujen esiintyvyydellä oli negatiivinen assosiaatio. Tästä voidaan päätellä, että ATP:n puutos ei aiheuttanut vajaatoimintaa solusyklin sääntelymekanismeissa. Paklitakseli ja suurin osa mitokondriotoksiineista näyttivät vaikuttavan tubuliinin ja aktiinin dynamiikkaan. DNA-katkoksilla ja solutukirankadynamiikan muutoksilla näytti olevan yhteys, mutta kausaliteettia näiden välillä ei tässä tutkimuksessa pystytty varmistamaan ja asia vaatii siten jatkotutkimuksia. Tässä tutkimuksessa ei varmistunut, johtuivatko mitokondriotoksiineiden aiheuttamat muutokset solutukirankadynamiikassa ja DNA-katkosten määrässä ATP;n puutoksesta vai kyseisten aineiden yleisestä solutoksisuudesta.Description
Supervisor
Frey, AlexanderThesis advisor
Karjalainen, MikkoHeikkinen, Pekka
Keywords
mitochondrial toxicity, ATP depletion, DNA damage, cytoskeleton dynamics, High-content analysis (HCA)