Expression of atromentin synthetase in yeast Saccharomyces cerevisiae and metabolic model-guided design of production optimization
Loading...
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Unless otherwise stated, all rights belong to the author. You may download, display and print this publication for Your own personal use. Commercial use is prohibited.
Author
Date
2024-06-11
Department
Major/Subject
Biotechnology
Mcode
CHEM3022
Degree programme
Master's Programme in Chemical, Biochemical and Materials Engineering
Language
en
Pages
49+2
Series
Abstract
Atromentin is a natural fungal pigment that exhibits interesting biological activities and functions as a precursor for many other fungal pigments. It is produced by a nonribosomal peptide synthetase -like enzyme, atromentin synthetase, that dimerizes 3-(4-hydroxyphenyl)pyruvate (HPP). However, the natural producers may not be cultivable in laboratory or application environments with simple growth media, and the secondary metabolite production is likely to be under complex regulation. Thus, for biotechnological production of the compound, the biosynthetic enzymes could be expressed in a heterologous host. In this study, atromentin synthetase encoded by AtrA gene was expressed in Saccharomyces cerevisiae. A 2760 bp long codon optimized version of AtrA (ATRO-opt) was integrated to the genome together with a strong native promoter pTDH3. This was accomplished with CRISPR-Cas9 techniques. Furthermore, genome-scale metabolic model simulations were used to strain modification targets for optimizing atromentin production. Found upregulation targets formed a coherent path towards production of HPP. These involved genes in upper glycolysis, chorismate biosynthesis, and in production of HPP from said chorismate. Alternatively, advantageous combinations of three non-lethal downregulation targets were formed. The best of these appear to direct the flux via glyoxylate cycle. One combination that could be tested is the downregulation of pyruvate carboxylases combined with knockouts of FUM1, SER3, and SER33. A strain synthesizing atromentin would be a valuable platform for the development of producer strains also for many other compounds. Additionally, production optimization strategies are valuable in the pursuit for achieving industrially attractive production levels.Atromentiini on luonnollinen sienipigmentti, jolla on mielenkiintoisia ominaisuuksia. Lisäksi se toimii monien muiden sienipigmenttien esiasteena. Atromentiinia tuottaa ei-ribosomaalisen peptidisyntetaasin kaltainen entsyymi, atromentiinisyntetaasi, joka dimeroi 3-(4-hydroksifenyyli)pyruvaattia (HPP). Atromentiinin luonnollisia tuotanto-organismeja olisi kuitenkin hankala viljellä laboratorio- tai tuotantoympäristöissä yksinkertaisilla kasvualustoilla, ja sekundääristen aineenvaihduntatuotteiden kuten atromentiinin synteesi on yleensä monimutkaisen säätelyn alaisena. Näin ollen atromentiinin bioteknistä tuotantoa varten biosynteettiset entsyymit olisi hyödyllistä ilmentää heterologisessa isännässä. Tässä tutkimuksessa AtrA-geenin koodaama atromentiinisyntetaasi ilmennettiin Saccharomyces cerevisiae hiivassa. 2760 emäsparia pitkä AtrA-geenin kodonioptimoitu versio (ATRO-opt) integroitiin genomiin yhdessä voimakkaan hiivan luonnollisen promoottorin (pTDH3) kanssa käyttämällä CRISPR-Cas9 tekniikkaa. Tämän ohella genomimittakaavan aineenvaihduntamallin simulaatioita käytettiin löytämään muokattavia geenejä ja reaktioita atromentiinin tuotannon optimoimiseksi. Löydetyt vahvistettavat geenit muodostivat johdonmukaisen polun HPP:n tuotantoon glykolyysin ja korismaatin biosynteesin kautta. Näiden lisäksi muodostettiin tuotantoa parantavia kolmen poistettavan reaktion yhdistelmiä. Parhaat näistä näyttävät ohjaavan aineenvaihduntavuota glyoksylaattisyklin kautta. Yksi tällainen yhdistelmä on pyruvaattikarboksylaasien hiljentäminen yhdistettynä FUM1, SER3 ja SER33 geenien poistoon. Atromentiinia tuottava kanta olisi arvokas alusta myös monien muiden yhdisteiden tuottajakantojen kehittämiselle. Lisäksi tuotannon optimointistrategiat ovat arvokkaita pyrittäessä saavuttamaan teollisesti houkuttelevia tuotantotasoja.Description
Supervisor
Jouhten, PaulaThesis advisor
Mekki, CelmaKeywords
nonribosomal peptide, nonribosomal peptide synthetase, heterologous expression, Saccharomyces cerevisiae, atromentin, genome-scale metabolic models
