Towards bioengineered alginates – Comparison of bacterial and algal alginates regarding gelling properties and spinnability
Loading...
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu |
Master's thesis
Authors
Date
Department
Major/Subject
Mcode
CHEM3028
Degree programme
Language
en
Pages
82+2
Series
Abstract
The goals of this Master’s thesis project were to compare wild type and modified bacterial alginate produced with Pseudomonas aeruginosa to algal alginate considering gelling properties and the synthesis of nanofiber mats by electrospinning. Chemical cross-linking with two techniques were also demonstrated. In addition, bi-component systems comprising alginate and chitosan were considered. P. aeruginosa strain PAO1 was chosen as the alginate-producing system. PAO1 is a non-mucoid strain, so the mucoid phenotype was induced by cultivating P. aeruginosa in Pseudomonas Isolation agar (PIA) supplemented with ammonium vanadium oxide (NH4VO3) (PIA-AMV). The purification process of alginate was optimized from various protocols concentrating on extracting alginate from other cellular components, verified by SDS-PAGE, agarose electrophoresis, MALDI-TOF, and FT-IR. The aim was to simplify and speed-up the time-consuming process, and still obtain the necessary purity. Algal sodium alginate was used as a standard. Alginate consists of β-D-mannuronic acid (M) and its C5-epimer α-L-guluronic acid (G) forming GG, MM or MG blocks. Alginate is synthetized as a polymannuronate, and modified in polymeric level. In P. aeruginosa, only one mannuronan C-5 epimerase, AlgG, converts polymannuronate chain into guluronic acid residues. By generating AlgG knock-out mutants, it was hypothesized that polymannuronate-only alginate would be achieved. Fragments containing kanamycin cassette flanked by a homologous region of the target locus were obtained from PCR reaction, and transformed to PAO1 containing a vector pUCP18-RedS containing lambda Red operons. Bacterial alginates were unable to form strong hydrogels or fibers on coagulation bath. Algal alginates on the other hand formed strong hydrogels and fibers. Block fractioning showed that bacterial alginate contained minimal amounts of GG-blocks whereas algal alginate contained over 50 % of them. GG-blocks are responsible of the formation of gels via interaction of bivalent cations thus explaining the different gelling properties of algal and bacterial alginates. To combine gene technology with the material development, algal and bacterial alginates were jet electrospinned with the help of a co-adjuvant polymer, poly(ethylene oxide) (PEO). Nanofiber mats were cross-linked with calcium and washed with water to end up with alginate-only fibers. A co-axial needle was experimented to form core-shell structures, with alginate as the core component and chitosan as the shell phase. The fiber formation was observed with SEM. The novelty of this project included the electrospinning of bacterial alginate, which, to our knowledge, have not been done before. It was demonstrated, that bacterial alginate can be electrospinned to form uniform nanofiber mats, which could in turn be cross-linked to fit to the tissue engineering applications.Diplomityön tavoitteena oli vertailla Pseudomonas aeruginosalla tuotettuja alginaatteja (villityyppi ja muokattu) leväalginaattiin geeliytymisen ja jännitekehräyksellä tuotettujen nanokuitumattojen valmistamisen suhteen. Kemikaalista silloittamista havainnollistettiin kahdella metodilla. Myös kitosaani-alginatti -kaksikomponenttisysteemejä harkittiin. P. aeruginosa kanta PAO1 valittiin alginaatin tuottajaksi. PAO1 on epämukoisa kanta, joten mukoisa fenotyyppi indusoitiin kasvattamalla bakteeria Pseudomonas Isolation -agarissa (PIA), johon oli lisätty ammonium vanadium oksidia (NH4VO3) (PIA-AMV). Alginaatin puhdistusprosessi optimoitiin useista protokollista keskittyen alginaatin erottamiseen muista solukomponenteista. Puhdistuksen onnistumista arvioitiin SDS-PAGE:lla, agaroosigeelielektroforeesilla, MALDI-TOF:illa ja FT-IR:llä. Tavoitteena oli yksinkertaistaa ja nopeuttaa aikaa vievää prosessia, ja saavuttaa silti tarvittava puhtaus. Leväalginaattia käytettiin standardina kaikissa mittauksissa. Alginaatti koostuu β-D-mannuronaatista (M) ja tämän C-5 epimeeri α-L-glukuronaatista (G), jotka muodostavat GG-, MM- tai MG-blokkeja. Alginaatti syntetisoidaan polymannuronaattiketjuna, ja muokataan edelleen polymeeritasolla. P. aeruginosalla on ainoastaan yksi mannuronan C-5- epimeraasi, AlgG, joka kääntää polymannuronaattiketjua glukuronaatiksi. Luomalla AlgG knock-out -mutantteja oletettiin, että saataisiin valmistettua ainoastaan mannuronaatista koostuvaa alginaattia. PCR-reaktiolla valmistettiin fragmentteja, jotka sisälsivät kanamysiinikasetin sekä homologisen alueen kohdegeenin lokukseen. Fragmentit transformoitiin PAO1-kantaan, joka sisälsi lambda Red -operonit sisältävän vektorin pUCp18-RedS:n. Bakteerialginaatit eivät muodostaneet kestäviä hydrogeelejä tai kuituja koagulaatioliuoksessa toisin kuin leväalginaatit. Fraktioinnin avulla saatiin selville, että bakteerialginaatti sisälsi minimaalisia määriä GG-blokkeja ja leväalginaatti puolestaan yli 50 prosenttia; GG-blokit vuorovaikuttavat kahdenarvoisten kationien kanssa luoden voimakkaita geelejä. Geeni- ja materiaalitekniikan yhdistämiseksi levä- ja bakteerialginaatteja jännitekehrättiin kantajapolymeeri polyetyleenioksidin (PEO) kanssa. Nanokuitumatot silloitettiin kalsiumliuoksilla ja pestiin vedellä. Näin saatiin valmistettua pelkkää alginaattia sisältäviä nanokuitumattoja. Kaksiaksiaalista neulaa käytettiin ydinkuorityyppisten rakenteiden luomiseen; Alginaatti toimi ydinkomponenttina ja kitosaani kuorena. Kuituja tutkittiin SEM:in avulla. Tämän projektin uutuusnäkökulma oli bakteerialginaatin jännitekehräys, jota ei tietääksemme ole tehty aiemmin. Osoitimme, että bakteerialginaattia voidaan jännitekehrätä tasaisten nanokuitumattojen luomiseksi, ja että matot voidaan edelleen silloittaa paremmin sopimaan kudosteknisiin sovelluksiin.Description
Supervisor
Frey, AlexanderThesis advisor
Rojas, OrlandoViskari, Heli