Recombinant protein secretion utilizing a vesicle nucleating peptide tag
Loading...
URL
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
School of Chemical Engineering |
Master's thesis
Authors
Date
Department
Major/Subject
Mcode
Language
en
Pages
68
Series
Abstract
This master’s thesis discusses a recently discovered vesicle nucleating peptide (VNp) tag, which has been shown to package recombinant proteins into extracellular vesicles in Escherichia coli. This innovative method considerably increases protein yield, allows secretion of toxic, insoluble, and disulfide-bond-containing proteins, offers long-term storage, and simplifies purification of the product. The aim of this thesis was to investigate the vesicle secretion method using VNp6-mScarlet fusion protein. VNp6 is a modified version of VNp and functions at lower temperatures. The construction of plasmids was done with Golden Gate cloning assembly using the Komagataeibacter tool kit (KTK), since further studies are planned in Komagataeibacter species. Four different expression tests were conducted in 25 mL cultures of E. coli BL21 (DE3) cells in lysogeny broth and terrific broth media at 25 °C and 37 °C cultivation temperatures with varying inducer concentrations. The hypothesis was that VNp6-mScarlet protein would be expressed and then packaged in vesicles. As a ref-erence, a control plasmid containing mScarlet protein without the VNp6 sequence was used. VNp6-induced vesicle formation was not observed in this study. SDS-PAGE results indicated that VNp6-mScarlet was expressed 4 hours after induction, but the protein was detected only in the cell pellet, indicating that vesicles were not secreted. Vesicles might have been present in the overnight samples when 37 °C and TB medium were used, as VNp6-mScarlet was detected in the supernatant samples. However, in one of the expression tests, scanning electron microscopy images indicated that cells were damaged, and vesicles were not detected. In other expression tests it was not possible to determine whether the vesicles were secreted or if the VNp6-mScarlet was present in the supernatant only due to cell lysis. In the expression test where LB medium and 25 °C cultivation temperature was used, cells were not lysed, but neither were vesicles secreted. Results obtained in this thesis indicate that the VNp6 method requires further optimization.Tämä maisterityö käsittelee hiljattain löydettyä vesikkelien muodostumista edistävää peptidiä (eng. vesicle nucleating peptide, VNp), jonka on osoitettu pakkaavan rekombinanttiproteiinit solunulkoisiin vesikkeleihin Escherichia colissa. Tämä innovatiivinen metodi parantaa merkittävästi proteiinien saantoa, mahdollistaa myrkyllisten, liukenemattomien ja disulfidisidoksia sisältävien proteiinien erittämisen, sekä parantaa proteiinien säilyvyyttä ja helpottaa tuotteen puhdistamista. Työn tavoitteena oli analysoida vesikkelien eritysmenetelmän toimivuus VNp6-mScarlet fuusioproteiinin avulla. VNp6 on modifioitu versio VNpstä ja toimii alhaisemmissa lämpötiloissa. Plasmidit rakennettiin Golden Gate menetelmään perustuvalla Komagataeibacter tool kit (KTK) avulla. Kyseistä kittiä käytettiin, sillä jatkotutkimuksia on suunniteltu Komagataeibacter lajeille. Neljä erilaista ekspressiokoetta suoritettiin 25 mL:n E. coli BL21 (DE3) soluviljemissä lysogeny broth- ja terrific broth -liuoksissa 25 °C:n ja 37 °C:n lämpötiloissa, sekä vaihtelevilla indusoijan pitoisuuksilla. Hypoteesina oli, että VNp6-mScarlet-proteiini ekspressoituisi ja tämän jälkeen pakkautuisi vesikkeleihin. Vertailukohteena käytettiin plasmidia, jossa oli mScarlet proteiini ilman VNp6-sekvenssiä. Työssä ei havaittu VNp6:sta johtuvaa vesikkelien muodostumista. SDS-PAGE tuloksista näkyi, että VNp6-mScarlet ekspressoitui neljä tuntia indusoinnista, mutta proteiinia havaittiin vain solupelletissä, mikä osoitti, ettei vesikkeleitä erittynyt. Vesikkeleitä saattoi olla yön yli näytteissä kun 37 °C ja TB-liuosta käytettiin, sillä VNp6-mScarlet proteiinia havaittiin supernatantti näytteissä. Kuitenkin yhdessä ekspressiokokeessa suoritettu pyyhkäisyelektronimikroskopointi osoitti, että solut olivat vaurioituneet ja vesikkeleitä ei havaittu. Muissa ekspressiokokeissa ei pystytty todistamaan oliko vesikkeleitä erittynyt, vai oliko VNp6-mScarlet proteiini supernatanttinäytteessä vain solukuoleman takia. Ekspressiokokeessa, joka suoritettiin 25 °C:ssa ja LB liuoksessa, solut eivät olleet hajonneet, muttei myöskään vesikkeleitä erittynyt. Tämän maisterityön tulokset osoittavat, että VNp6-metodi tarvitsee lisää optimointia.Description
Supervisor
Mangayil, RahulThesis advisor
Vannas, JenniFan, Ruxia