Identification of proteins binding to Pseudomonas aeruginosa flavohemoglobin promoter: in vitro and in silico analysis

Abstract

Pseudomonas aeruginosa -bakteeri on opportunistinen ihmispatogeeni, joka aiheuttaa infektioita etenkin potilaille, joiden puolustuskyky on heikentynyt. Tiedetään, että P. aeruginosa fiavohemoglobiini (HmpPa) pystyy detoksifoimaan NO-yhdisteen ja suojelemaan näin heterologista Escherichia coli -bakteeria nitrosatiiviselta stressitilalta. Tästä johtuen kiinnostus HmpPa proteiiniin on merkittävä. Tämän työn tavoitteena oli tutkia P. aeruginosa hmp geenin säätelyä käyttäen in vitro ja in silico analyysejä.

Kirjallisuusosassa käsitellään P. aeruginosa -bakteerin patogeenisuuteen vaikuttavia tekijöitä syventymällä virulenssitekijöihin ja niiden säätelyyn. Lisäksi tarkastellaan bakteeriperäisten globiiniproteiinien tehtäviä ja säätelyä sekä tutkitaan niiden mahdollista osallisuutta bakteerien virulenssiin.

Työn kokeellisessa osassa kehitettiin menetelmä, jonka avulla pystytään eristämään spesifisesti säätelyproteiineja, jotka sitoutuivat HmpPa geenin promoottorialueelle käyttäen magneettisia streptavidinilla päällystettyjä Dynabead-partikkeleita. Säätelyproteiinit, jotka sitoutuvat sekä P. aeruginosa -bakteerin PAOI -villityyppikannan että kliinisen CPA2-kannan hmp geenin promoottorialueelle eristettiin ja tunnistettiin. sigma54 -tekijää koodaavan rpoN geenin, happitasoon reagoivan ANR proteiinin ja LasRI quorumsensing -systeemin vaikutusta hmp geenin ilmenemiseen tutkittiin sekä mikroaerobisissa olosuhteissa että nitrosatiivisen stressitekijän ja quorum-sensing autoinduuseriyhdisteen läsnäollessa. in silico -analyysillä tunnistettiin mahdollisten hmp geenin ilmenemiseen vaikuttavien proteiinien sitoutumiselementit.

Kolme todennäköisesti HmpPa geeniä säätelevää proteiinia eristettiin in vitro: sigma54 -riippuvainen säätelyproteiini PA2665 (NorR), jota koodaava geeni sijaitsee 154 bp hmp geenin jälkeen vastakkaisella DNA juosteella, hypoteettinen proteiini PA3697 ja ATP -riippuvainen proteaasi PA0779. Eroja kantojen PAO1 ja CPA2 hmp geenin säätelyssä ei havaittu. Ilmenemiskokeiden ja in silico -analyysin perusteella hmp promoottorin todettiin olevan sigma54 -säätelemä. ANR proteiinin havaittiin vaikuttavan positiivisesti hmp geenin ilmenemiseen nitrosatiivisessa stressiolosuhteissa. LasRI-systeemillä ei todettu olevan positiivista vaikutusta hmp geenin ilmenemiseen. In silico analyysin perusteella RhlR -proteiini sekä IHF -proteiini sitoutuvat todennäköisesti hmp promoottorialueelle ja NO- tasoon reagoiva DNR -säätelyproteiini puolestaan norR geenin promoottorialueelle.