Utilization of PHI6 P2 polymerase in the production of double-stranded RNA

dc.contributorAalto-yliopistofi
dc.contributorAalto Universityen
dc.contributor.advisorTieaho, Ville
dc.contributor.authorAhlfors, Sonja
dc.contributor.departmentKemian tekniikan osastofi
dc.contributor.schoolTeknillinen korkeakoulufi
dc.contributor.schoolHelsinki University of Technologyen
dc.contributor.supervisorNordström, Katrina
dc.date.accessioned2020-12-05T09:41:24Z
dc.date.available2020-12-05T09:41:24Z
dc.date.issued2006
dc.description.abstractTyön kirjallisuusosassa on esitetty RNAi-vasteen vaiheet sekä eri tuotantotapoja RNAi-vasteen nostaville siRNA-molekyyleille. Kirjallisuusosassa on pohdittu tuotantotapojen hyötyjä ja ongelmia, sekä potentiaalisia sovelluksia siRNA-molekyyleille. Lisäksi kirjallisuusosassa on esitetty kokeellisessa osassa käytetyt RNA-polymeraasit (T7 RNA- ja FII6 P2-polymeraasi). Diplomityön kokeellisen osan tavoitteena oli kehittää menetelmä jonka avulla voidaan tuottaa RNAi-kokeisiin soveltuvaa kaksijuosteista RNA:ta (dsRNA). Kokeellinen osa aloitettiin määrittämällä P2-polymeraasin optimaaliset reaktio-olosuhteet tiettyjen puskurikomponenttien suhteen, sekä tutkimalla polymeraasin promoottori- ja templaattivaatimuksia. Promoottorikokeista kävi ilmi, että polymeraasi on parhaiten hyödynnettävissä pitkää promoottorisekvenssiä käytettäessä. Templaattikokeista nähtiin, että P2-polymeraasi pystyy transkriptoimaan hyvin vaihtelevan kokoisia denaturoituja DNA-templaatteja. Transkriptioreaktiolla tuotetun kaksijuosteisen RNA:n saanto jäi kuitenkin alle odotusten. Syy reaktion loppumiselle jäi selvittämättä, vaikka reaktio-olosuhteiden muuttumista ja entsyymin inaktivoitumista tutkittiin. Seuraavassa vaiheessa hyödynnettiin P2-polymeraasin replikaatioaktiivisuutta siten, että T7 RNA -polymeraasi transkriptoi yksijuosteista RNA:ta jonka P2-polymeraasi replikoi kaksijuosteiseksi. Tässä osuudessa tutkittiin tarkemmin molempien entsyymien reaktio-olosuhteita. RNA-polymeraasien yhteisreaktiolle pystyttiin kehittämään yhteinen reaktiopuskuri, joka ylläpiti molempien entsyymien aktiivisuutta, vaikka alustavissa kokeissa näytti siltä, että kaksi reaktiokomponenttia (mangaani ja spermidiini) saattaisivat muodostua ongelmaksi. Reaktion saantoa saatiin lisäksi huomattavasti parannettua käyttämällä korkeampaa nukleotidikonsentraatiota sekä lisäämällä reaktioon DNA-templaattia sekä T7 RNA -polymeraasia. Lopuksi tehtiin vertailukokeita kolmella (900 bp, 650 bp ja 20 kb) templaatilla. Kokeissa verrattiin kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti kehitetyllä menetelmällä tuotettua dsRNA:ta reaktioon, jossa dsRNA oli tuotettu T7 RNA -polymeraasin avulla. Vertailukokeista nähtiin selvästi, että kehitetyllä menetelmällä syntyi huomattavasti vähemmän epäspesifisiä tuotteita verrattaessa T7 RNA -polymeraasin reaktioon. RNA-polymeraasien yhteisreaktiossa oli hieman enemmän replikoimatta jäänyttä yksijuosteista RNA:ta, mutta tästä huolimatta kaksijuosteisen tuotteen saanto oli melko sama molemmilla menetelmillä. Suurella templaatilla (20 kb) tehdyllä kokeella ilmeni, että kehitetyllä menetelmällä on mahdollista tuottaa hyvin suurta kaksijuosteista RNA:ta, jonka tuottaminen ei ole mahdollista vertailumenetelmällä.fi
dc.format.extentx + 94 s. + liitt. 5
dc.identifier.urihttps://aaltodoc.aalto.fi/handle/123456789/93500
dc.identifier.urnURN:NBN:fi:aalto-2020120552335
dc.language.isofien
dc.programme.majorBiokemia ja mikrobiologiafi
dc.programme.mcodeKem-30fi
dc.rights.accesslevelclosedAccess
dc.titleUtilization of PHI6 P2 polymerase in the production of double-stranded RNAen
dc.titleFII6-faagin P2-polymeraasin hyödyntäminen kaksijuosteisen RNA-tuotossafi
dc.type.okmG2 Pro gradu, diplomityö
dc.type.ontasotMaster's thesisen
dc.type.ontasotPro gradu -tutkielmafi
dc.type.publicationmasterThesis
local.aalto.digiauthask
local.aalto.digifolderAalto_14225
local.aalto.idinssi31480
local.aalto.openaccessno

Files