Comparison of two multiplex PCR methods and the hippurate hydrolysis test in differentiating Campylobacter jejuni and C. coli

Abstract

Työn tarkoituksena oli saada tietoa humaani-infektioita aiheuttaneiden kampylobakteerien lajeista. Työssä pystytettiin kaksi erilaista monialukkeista PCR-menetelmää kampylobakteerilajien tunnistamista ja erottamista varten.

Kampylobakteerit ovat yleisimpiä suolistoinfektioiden aiheuttajia. Ne ovat gramnegatiivisia, itiöimättömiä ja liikkuvia bakteereja, joilla on matala G + C pitoisuus ja mikroaerobiset kasvuvaatimukset. Tartunnan voi saada vaillinaisesti kypsennetystä eläinperäisistä elintarvikkeista, pilaantuneesta vedestä tai läheisestä kontaktista eläimen kanssa. Tautiin liittyy ripuli sekä korkea kuume ja kovat vatsakivut, jotka helpottavat 3-4 päivän jälkeen. Jälkitautina voi ilmetä muun muassa reaktiivista niveltulehdusta. Yleisimmät ihmisille infektioita aiheuttavat lajit ovat C. jejuni (90-95 %) ja C. coli (5-10 %).

Termofiiliset kampylobakteerit voidaan eristää kasvattamalla niitä mikroaerobisissa olosuhteissa 42 °C:n lämpötilassa. Kampylobakteerit voidaan tunnistaa pesäkkeen ulkonäön, oksidaasitestin ja gramvärjäyksen avulla. Hippuraattitesti on yleisimmin käytetty menetelmä C. jejuni -lajin erottamiseen muista kampylobakteerilajeista. Osalla C. jejuni -kannoista hippuraattitestin tulos on kuitenkin poikkeuksellisesti negatiivinen.

Työssä pystytettiin kaksi erilaista monialukkeista PCR-menetelmää. Lajispesifiseen ceuE -geeniin perustuvalla menetelmällä voitiin tunnistaa C. jejuni ja C. coli -lajit. Useaan eri geeniin perustuvalla viiden lajin menetelmällä voitiin tunnistaa näiden kahden lajin lisäksi C. fetus, C. lari ja C. upsaliensis. Menetelmiä testattiin 150 potilaskannalla, joista 100 oli hippuraattinegatiivisia ja 24 hippuraattipositiivisia. Lisäksi mukana oli 26 kantaa, joiden hippuraattitestin tulos oli epäselvä heikosti positiivinen. Kaikki hippuraattipositiiviset lajit todettiin PCR-menetelmillä C. jejuni -kannoiksi. Hippuraattinegatiivisista kannoista 63 oli C. coli -kantoja ja 36 C. jejuni - kantoja. Yksi kannoista osoittautui C. fetus -lajiksi. Hippuraattitestissä heikon positiivisen tuloksen antaneista kannoista osoittautui C. jejuni -kannoiksi vain osa (5/8).

Työn tulokset osoittavat, että hippuraattitesti ei yksin riitä kampylobakteerien luotettavaan lajinmääritykseen, vaan kaikkien hippuraattinegatiivisten ja heikon positiivisen tuloksen antaneiden kantojen laji tulisi varmistaa esimerkiksi PCR-menetelmällä. Viiden lajin menetelmä oli parempi kuin ceuE -geeniin perustuva menetelmä, koska sillä saatiin tulos kaikista kannoista. Menetelmän etuja olivat myös sisäisenä kontrollina toimiva 23S rRNA-fragmentti, mahdollisuus tunnistaa useampi laji sekaviljelmästä sekä viiden kampylobakteerilajin tunnistaminen.