Immunodetection methods for aflatoxin

No Thumbnail Available
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Kemian tekniikan korkeakoulu | Master's thesis
Date
2021-06-14
Department
Major/Subject
Biosystems and Biomaterials Engineering
Mcode
CHEM3028
Degree programme
Master’s Programme in Life Science Technologies
Language
en
Pages
63 + 7
Series
Abstract
Toxins, aflatoxins being among them, destroy 25 % or more of the world’s food crops annually.Aflatoxins are poisonous organic compounds produced by fungal species. Aflatoxins have been found in all major food crops, but contaminated nuts, grains and their derived products are the most common source for human aflatoxin exposure. Aflatoxin can also be found in milk and milk products (aflatoxin M1), if aflatoxin containing grain has been used for animal feed. Acute aflatoxin poisoning can be life threatening and long-term exposure with low amount of aflatoxin can cause serious health problems. Aflatoxins are found all around the world, which makes aflatoxin a serious worldwide food and health risk to humans and livestock. However, the detection of aflatoxins from food products can be challenging and new fast, easy, and specific detection methods are needed. This master’s thesis studies the possible development and discovery of anti-immunocomplex antibodies from phage display library and their use in noncompetitive immunocomplex assay for aflatoxin M1 detection. Two anti-aflatoxin antibodies are produced and one of them is applied for the discovery of anti-immunocomplex antibodies for rapid diagnostics of aflatoxin M1. Discovery of anti-immunocomplex antibodies includes selection of antibodies from the VTT human naïve single chain antibody phage display library and screening of single antibody clones for their binding activity. Anti-aflatoxin (21) Fab and anti-aflatoxin 21(A10) Fab were successfully produced and purified. Anti-aflatoxin (21) Fab was applied to the development of anti-immunocomplex antibodies for aflatoxin M1 detection, which resulted in the discovery of a primary positive anti-immunocomplex antibody for the rapid diagnostics of aflatoxin M1. However, the phage ELISA results were not reliably reproducible. The challenge with the result repeatability appeared to be in the stability of the phage displayed antibodies. It was evident, that the development of anti-immunocomplex antibodies with this method require further optimization and verification experiments especially regarding to result reproducibility before reliable conclusion can be drawn.

Toksiinit, aflatoksiinit mukaan lukien, tuhoavat 25 % tai enemmän maailman ruokasadosta vuosittain. Aflatoksiinit ovat myrkyllisiä homesienten tuottamia orgaanisia yhdisteitä. Aflatoksiineja on löydetty kaikista yleisimmistä ruokasadoista, mutta kontaminoidut pähkinät, viljat ja näiden johdannaistuotteet ovat yleisimmät lähteet ihmisten aflatoksiinialtistumisille. Aflatoksiinia voidaan myös löytää maidosta ja maitotuotteista (aflatoksiini M1), jos aflatoksiinia sisältävää viljaa on käytetty eläinrehuna. Akuutti aflatoksiinimyrkytys voi olla hengenvaarallinen ja pitkäaikainen altistuminen alhaiselle määrälle aflatoksiinia voi aiheuttaa vakavia terveysongelmia. Aflatoksiineja tavataan ympäri maailmaa, mikä tekee aflatoksiineista maailmanlaajuisen ruoka- ja terveysriskin ihmisille sekä karjalle. Kuitenkin aflatoksiinien havaitseminen ruokatuotteista saattaa olla hankalaa ja uusia nopeita, helppoja ja tarkkoja detektiomenetelmiä tarvitaan. Tämä diplomityö tutkii mahdollisten anti-immunokompleksisten vasta-aineiden kehittämistä ja löytämistä faaginäyttökirjastosta ja näiden käyttöä immunokompleksianalyysissä aflatoksiini M1 havaitsemiseksi. Kaksi anti-aflatoksiinista vasta-ainetta tuotetaan ja toista näistä käytetään anti-immunokompleksisten vasta-aineiden löytämiseen aflatoksiini M1 pikadiagnostiikkaa varten. Anti-immunokompleksisten vasta-aineiden löytäminen vaatii vasta-aineiden selektiota VTT:n yksiketjuisesta vasta-aineiden faaginäyttökirjastosta ja yksittäisten vasta-ainekloonien seulontaa niiden sitoutumisaktiivisuuden perusteella. Anti-aflatoksiini (21) Fab ja anti-aflatoksiini 21(A10) Fab tuotettiin ja puhdistettiin onnistuneesti. Anti-aflatoksini (21) Fab käytettiin anti-immunokompleksisten vasta-aineiden löytämiseen aflatoksiini M1 detektointia varten, minkä seurauksena löydettiin alustavasti positiivinen anti-immunokompleksinen vasta-aine aflatoksiini M1 pikadiagnostiikkaa varten. Kuitenkaan faagi-ELISA:n tulokset eivät olleet luotettavasti toistettavissa. Haaste tulosten toistettavuudessa oli ilmeisesti faagien pinnalla olevien vasta-aineiden säilyvyydessä. Oli ilmeistä, että anti-immunokompleksisten vasta-aineiden tuottaminen tällä menetelmällä vaatii lisää optimointia ja varmentavia kokeita erityisesti tulosten toistettavuuden kannalta ennen kuin luotettavia johtopäätöksiä voidaan tehdä.
Description
Supervisor
Frey, Alexander
Thesis advisor
Nevanen, Tarja
Keywords
aflatoxin, antibody, Fab, anti-immunocomplex antibody, phage display
Other note
Citation