Molecular assembly routes for biological materials

Loading...
Thumbnail Image
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
School of Chemical Technology | Doctoral thesis (article-based) | Defence date: 2022-06-10
Date
2022
Major/Subject
Mcode
Degree programme
Language
en
Pages
78 + app. 108
Series
Aalto University publication series DOCTORAL THESES, 74/2022
Abstract
Biological materials present a wide variety of functional properties that provide inspiration for the development of new synthetic biomaterials. For example, spider silk has been extensively studied due to its exceptional toughness and adhesion properties. The exact pathway leading to the correct molecular assembly, which is the foundation of its extraordinary mechanical properties, is a complex process and not fully understood. This is one of the main reasons why the properties of synthetic silk materials are inferior to natural ones. This thesis attempts to answer the question of how recombinant spider silk proteins can be brought together in soluble form in a way that enables the interactions and microstructures that yield strong materials. The possible role of liquid-liquid phase separation, also known as coacervation, in the correct molecular assembly is of special interest. It has been suggested that many other natural organisms utilize coacervation as an intermediate step to produce functional materials, so gaining more information about its role on molecular assembly would be of great value to materials science. In publication I the coacervation of a recombinant spider silk-like protein, CBM-eADF3-CBM, was studied as an intermediate step for fiber assembly. Depending on the conditions, two kinds of coacervates were obtained: liquid-like and solid-like coacervates, but only the liquid-like ones enabled fiber formation and thus were more interesting for further studies. Publication II focused on the effect of molecular crowding on coacervation of CBM-eADF3-CBM. Dextran was used as an inert crowding agent, which enabled studying phase separation in lower protein concentrations, and in a controlled set-up. Furthermore, this set-up enabled thermodynamic studies of the system, which provided insight into the coacervation mechanism. Publication III presents the adhesion properties of CBM-eADF3-CBM in a system with delignified cellulose. Delignified cellulose proved to be a well-functioning model system to study silk as an adhesive, and CBM-eADF3-CBM formed a strong adhesive system with it. A method to produce native-sized recombinant silk proteins was developed in publication IV, and the effect of protein length on coacervation was studied. Post-translational in vitro ligation with the SpyCatcher2-SpyTag protein-peptide pair proved to be a robust way to produce native-sized silk proteins with high yield and solubility. Lengthening the protein lowered the critical concentration needed for coacervation and provided insight into the molecular interactions that lead to phase separation. To conclude, the results show that engineered recombinant silk proteins can be used to gain a deeper understanding of the molecular assembly behind the material formation process. Coacervation proved to be an important step in material formation and the methods to study it developed in this thesis increased the knowledge of molecular assembly processes.

Biologiset materiaalit tarjoavat laajan valikoiman toiminnallisia ominaisuuksia, jotka inspiroivat uusien synteettisten biomateriaalien kehitystä. Esimerkiksi hämähäkin silkkiä on tutkittu laajasti sen poikkeuksellisten mekaanisten ja adheesio-ominaisuuksien vuoksi. Välivaiheet, jotka johtavat molekyylien oikeaan järjestäytymiseen, ja jotka ovat hämähäkin silkin erinomaisten mekaanisten ominaisuuksien perusta, ovat monimutkaisia, eikä niitä vielä ymmärretä kunnolla. Tämä on yksi suurimmista syistä, jonka takia synteettiset silkkimateriaalit ovat ominaisuuksiltaan huonompia kuin luonnolliset materiaalit. Tämä väitöskirja pyrkii vastaamaan siihen, miten saamme tuotua rekombinanttiset hämähäkin silkkiproteiinit yhteen liukoisessa muodossa niin, että ne voivat muodostaa vahvojen materiaalien edellyttämät vuorovaikutukset ja mikrorakenteet. Neste-neste faasierottumisen (koaservoitumisen) rooli molekyylien järjestäytymiselle on erityisen kiinnostava. Useiden luonnon organismien uskotaan käyttävän koaservaatiota välivaiheena toiminnallisten materiaalien tuottamisessa. Siksi materiaalitieteelle olisi erittäin tärkeää, että sen rooli molekyylien järjestäytymiselle ymmärrettäisi paremmin. Julkaisussa I tutkittiin rekombinanttisen silkinkaltaisen proteiinin, CBM-eADF3-CBM, koaservaatiota välivaiheena kuitujen muodostumiselle. Olosuhteita muuttamalla saatiin aikaan kahdenlaisia koaservaatteja: nestemäisiä ja kiinteitä. Nestemäiset koaservaatit mahdollistivat kuitujen vedon ollen siksi kiinnostavampia lisätutkimuksille. Julkaisussa II tutkittiin molekulaarisen pakkaamisen (crowding) vaikutusta CBM-eADF3-CBM:n koaservaatiolle. Dekstraania käytettiin inerttinä pakkausaineena ja se mahdollisti faasierottumisen tutkimisen matalammassa konsentraatiossa ja kontrolloidussa systeemissä. Dekstraani mahdollisti myös koaservaation termodynamiikan tutkimisen, mistä saimme lisätietoa koaservaation mekanismista. Julkaisu III esittää CBM-eADF3-CBM:n ahdeesio-ominaisuudet delignifioidun selluloosan kanssa. Delignifioitu selluloosa osoittautui hyväksi mallisysteemiksi adheesion tutkimiselle ja CBM-eADF3-CBM muodosti vahvan adheesion sen kanssa. Julkaisussa IV kehitettiin metodi luonnollisen kokoisten silkkiproteiinien tuottamiseksi ja tutkittiin proteiinin pituuden vaikutusta koaservaatioon. Translaation jälkeinen in vitro -ligaatio SpyCatcher2-SpyTag proteiini-peptidi -parin avulla osoittautui tehokkaaksi tavaksi tuottaa luonnollisen kokoisia silkkiproteiineja. Proteiinin pidentäminen alensi koaservaation vaatimaa kriittistä konsentraatiota ja lisäsi tietämystämme faasierottumiseen johtavasta molekyylien järjestäytymisestä. Yhteenvetona tulokset osoittavat, että rekombinanttisia silkkiproteiineja voidaan käyttää materiaalien muodostumiseen johtavan molekyylien järjestäytymisen ymmärtämiseen. Koaservaatio osoittautui tärkeäksi välivaiheeksi materiaalin muodostumiselle ja tässä väitöskirjassa kehitetyt tutkimusmetodit lisäsivät tietoa molekyylien järjestäytymisprosesseista.
Description
Supervising professor
Linder, Markus, Prof., Aalto University, Department of Bioproducts and Biosystems, Finland
Thesis advisor
Aranko, A. Sesilja, Dr., Aalto University, Finland
Keywords
liquid-liquid phase separation, coacervation, recombinant protein, spider silk, adhesion, in vitro ligation, neste-neste faasierottuminen, koaservaatio, rekombinanttisilkkiproteiini, hämähäkin silkki, adheesio, in vitro -ligaatio
Other note
Parts
  • [Publication 1]: Mohammadi, Pezhman; Aranko, A. Sesilja; Lemetti, Laura, Cenev, Zoran; Zhou, Quan; Virtanen, Salla; Landowski, Christopher P.; Penttilä, Merja; Fischer, Wolfgang J.; Wagermaier, Wolfgang; Linder, Markus B. “Phase transitions as intermediate steps in the formation of molecularly engineered protein fibers” Comm. Biol., 1, 1-12 (2018).
    Full text in Acris/Aaltodoc: http://urn.fi/URN:NBN:fi:aalto-201809215148
    DOI: 10.1038/s42003-018-0090-y View at publisher
  • [Publication 2]: Lemetti, Laura; Hirvonen, Sami-Pekka; Fedorov, Dmitrii; Batys, Piotr; Sammalkorpi, Maria; Tenhu, Heikki; Linder, Markus B.; Aranko, A. Sesilja. ” Molecular crowding facilitates assembly of spidroin-like proteins through phase separation” Eur. Polym. J., 112, 539-546 (2019).
    Full text in Acris/Aaltodoc: http://urn.fi/URN:NBN:fi:aalto-201904022473
    DOI: 10.1016/j.eurpolymj.2018.10.010 View at publisher
  • [Publication 3]: Lemetti, Laura; Tersteegen, Jennifer; Sammaljärvi, Juuso; Aranko, A. Sesilja; Linder, Markus B., “Recombinant spider silk protein and delignified wood form a strong adhesive system” ACS Sustain. Chem. Eng. 10, 552–561 (2021).
    Full text in Acris/Aaltodoc: http://urn.fi/URN:NBN:fi:aalto-202201121172
    DOI: 10.1021/acssuschemeng.1c07043 View at publisher
  • [Publication 4]: Lemetti, Laura; Scacchi, Alberto; Yin, Yin; Shen, Mengjie; Linder, Markus B.; Sammalkorpi, Maria; Aranko, A. Sesilja, “The liquid-liquid phase-separation and assembly of silklike proteins is dependent on the polymer length”. Submitted to Biomacromolecules
Citation