Mitochondrial dysfunction as a source for misleading positives in in vitro DNA damage assays

 |  Login

Show simple item record

dc.contributor Aalto-yliopisto fi
dc.contributor Aalto University en
dc.contributor.advisor Karjalainen, Mikko
dc.contributor.advisor Heikkinen, Pekka
dc.contributor.author Ahola, Pihla
dc.date.accessioned 2018-09-03T12:38:19Z
dc.date.available 2018-09-03T12:38:19Z
dc.date.issued 2018-08-20
dc.identifier.uri https://aaltodoc.aalto.fi/handle/123456789/33721
dc.description.abstract Drug toxicity testing is a necessary part of the drug development process and it is required by the regulatory authorities. Genotoxicity, the ability of drugs to cause DNA damage, is tested by both in vivo and in vitro tests. In vitro DNA damage assays have high sensitivity but low specificity and hence they cause misleading positive results, which leads to unnecessary animal testing. Animal testing is expensive and causes ethical issues. Drugs that cause dysfunction in mitochondria are called mitochondrial toxins. Since the majority of the ATP is produced in mitochondria, mitochondrial toxins may cause insufficient energy production in mammalian cells. Since many processes in the cell, such as the cell cycle regulation, DNA damage repair and cytoskeleton dynamics, are energy dependent, the ATP depletion could possibly lead to indirect DNA damage response. The aim of this study was to investigate if the ATP depletion caused by the mitochondrial toxins induces the DNA damage indirectly and hence lead to misleading positive results in genotoxic assays. The focus was on examining whether the ATP depletion would cause DNA damage via changed dynamics of cytoskeleton. The study was conducted with High-content analysis (HCA). HepG2/C3A cells were treated with 16 compounds, 15 mitochondrial toxins and one genotoxic agent, paclitaxel. The cells were immunolabeled to detect tubulin and actin fibers, nuclei, DNA double strand breaks and mitotic cells. Excluding metformin, all of the mitochondrial toxins did increase the DNA damage response significantly (p<0.05) in HepG2/C3A cells. Most of these compounds seemed to increase the DNA damage due to the cell death. However, most of the compounds that interfere with ATP production via uncoupling, increased DNA damage response without the cell death. Paclitaxel was the only compound that increased both the DNA double strand break marker and the mitotic marker simultaneously. Since the DNA damage marker and mitosis marker had a negative correlation it can be concluded that energy depletion did not cause dysfunction in the cell cycle regulation. Paclitaxel and most of the mitochondrial toxins seemed to affect the tubulin and actin dynamics. There appeared to be association between DNA damage and changed cytoskeleton dynamics but the causality of the two was not verified and requires further investigation. Whether the responses were due to the ATP depletion or general cytotoxicity of the mitochondrial toxins, was not confirmed in this study. en
dc.description.abstract Lääkkeiden toksisuuden testaaminen on oleellinen osa lääkekehityskaarta ja lääkevalvontaviranomaiset velvoittavat sitä myyntilupaa hakevilta valmisteilta. Lääkkeet, jotka aiheuttavat vaurioita suoraan DNA:han, ovat genotoksisia. Genotoksisuutta tutkitaan niin in vivo- kuin in vitro -menetelmillä. DNA-vaurioiden tutkimista varten kehitellyt in vitro –testit ovat herkkiä, mutta epäspesifisiä, mistä johtuen ne antavat harhaanjohtavia positiivisia tuloksia. Tämä johtaa turhiin eläinkokeisiin, jotka ovat kalliita ja herättävät eettisiä kysymyksiä. Mitokondrioihin vaikuttavat toksiinit aiheuttavat mitokondrioiden vajaatoimintaa ja koska suurin osa nisäkässolujen ATP-tuotannosta tapahtuu niissä, voi solujen altistuminen näille toksiineille johtaa riittämättömään energiatuotantoon. Monet solussa tapahtuvat prosessit, kuten solusyklin sääntely, DNA:n korjausmekanismit ja solutukirankadynamiikka, ovat energiariippuvaisia. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, voiko mitokondriotoksisuudesta johtuva energiavaje johtaa epäsuorasti DNA-vaurioihin ja aiheuttaa siten harhaanjohtavia positiivisia tuloksia genotoksisuustesteissä. Työssä keskityttiin tutkimaan, aiheuttiko ATP:n puutos DNA-vaurioita nimenomaan muuttuneen solutukirankadynamiikan vuoksi. Tämä tutkimus suoritettiin High-content analysis (HCA) –metodilla. HepG2/C3A-solut käsiteltiin 16:lla aineella, joista 15 oli mitokondriotoksisia ja yksi, paklitakseli, genotoksinen. Soluille suoritettiin vasta-ainevärjäys, jolla paikallistettiin solujen tumat, mikrotubulukset, aktiinisäikeet, DNA-katkokset ja mitoottiset solut. Metformiinia lukuun ottamatta kaikki mitokondriotoksiinit lisäsivät DNA-katkosten määrää merkitsevästi (p<0.05) HepG2/C3A-soluilla. Suurella osalla näistä toksiineista DNA-katkosten lisääntyminen näytti johtuvan solukuolemasta. Aineet, jotka aiheuttivat ATP:n puutosta irtikytkennästä johtuen, lisäsivät DNA-katkosten määrää, vaikka solukuolemien määrä ei lisääntynyt. Paklitakseli oli ainoa aine, joka lisäsi sekä DNA-katkosten että mitoottisten solujen osuutta samanaikaisesti. Muilla aineilla DNA-katkosten ja mitoottisten solujen esiintyvyydellä oli negatiivinen assosiaatio. Tästä voidaan päätellä, että ATP:n puutos ei aiheuttanut vajaatoimintaa solusyklin sääntelymekanismeissa. Paklitakseli ja suurin osa mitokondriotoksiineista näyttivät vaikuttavan tubuliinin ja aktiinin dynamiikkaan. DNA-katkoksilla ja solutukirankadynamiikan muutoksilla näytti olevan yhteys, mutta kausaliteettia näiden välillä ei tässä tutkimuksessa pystytty varmistamaan ja asia vaatii siten jatkotutkimuksia. Tässä tutkimuksessa ei varmistunut, johtuivatko mitokondriotoksiineiden aiheuttamat muutokset solutukirankadynamiikassa ja DNA-katkosten määrässä ATP;n puutoksesta vai kyseisten aineiden yleisestä solutoksisuudesta. fi
dc.format.extent 85+13
dc.format.mimetype application/pdf en
dc.language.iso en en
dc.title Mitochondrial dysfunction as a source for misleading positives in in vitro DNA damage assays en
dc.title Mitokondrioiden vajaatoiminta lähteenä in vitro DNA-vaurioanalyyseissä ilmenneille harhaanjohtaville positiivisille tuloksille fi
dc.type G2 Pro gradu, diplomityö fi
dc.contributor.school Kemian tekniikan korkeakoulu fi
dc.subject.keyword mitochondrial toxicity en
dc.subject.keyword ATP depletion en
dc.subject.keyword DNA damage en
dc.subject.keyword cytoskeleton dynamics en
dc.subject.keyword High-content analysis (HCA) en
dc.identifier.urn URN:NBN:fi:aalto-201809034846
dc.programme.major Biosystems and Biomaterials Engineering fi
dc.programme.mcode CHEM3028 fi
dc.type.ontasot Master's thesis en
dc.type.ontasot Diplomityö fi
dc.contributor.supervisor Frey, Alexander
dc.programme Master’s Programme in Life Science Technologies fi
dc.location PK fi
local.aalto.electroniconly yes
local.aalto.openaccess yes


Files in this item

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record

Search archive


Advanced Search

article-iconSubmit a publication

Browse

My Account