A functional genomics approach to the study of alkaloid biosynthesis and metabolism in Nicotiana tabacum and Hyoscyamus muticus cell cultures

 |  Login

Show simple item record

dc.contributor Aalto-yliopisto fi
dc.contributor Aalto University en
dc.contributor.author Häkkinen, Suvi T.
dc.date.accessioned 2012-02-24T09:09:42Z
dc.date.available 2012-02-24T09:09:42Z
dc.date.issued 2008-11-07
dc.identifier.isbn 978-951-38-7124-6
dc.identifier.issn 1455-0849
dc.identifier.uri https://aaltodoc.aalto.fi/handle/123456789/3019
dc.description.abstract The aim of this work was to improve understanding of the regulation of alkaloid biosynthesis in two Solanaceae plants, Nicotiana tabacum (tobacco) and Hyoscyamus muticus (Egyptian henbane). In order to map the biosynthetic genes involved in the tobacco alkaloid pathway, a functional genomics-based technology was established by combining genome-based transcript profiling (cDNA-AFLP) with targeted metabolite analysis. Altogether 459 genes were found to be differentially expressed in methyl jasmonate-elicited N. tabacum BY-2 cells. Homology searches performed with these genes revealed that 58 % of the genes displayed similarity with genes having known functions, whereas no sequence similarity was found with 26 % of the genes, suggesting that some of them may take part in unknown steps in tobacco alkaloid biosynthesis. Alkaloids accumulated 12 hours after methyl jasmonate application, with varying kinetic patterns. For the first time the alkaloid anatalline was shown to accumulate in Nicotiana cell cultures, and together with anatabine they formed the main alkaloid pool. Anatalline was further characterized structurally as being present in two isomeric forms, anatalline and trans-2,4-di(3-pyridyl)piperidine. Contrary to the case in whole tobacco plants, nicotine was only a minor alkaloid accumulating in elicited cells, whereas the production of a precursor methylputrescine was highly induced. Based on these results, it was suggested that the limiting step in nicotine biosynthesis occurred between methylputrescine and nicotine. Altogether 34 methyl jasmonate-modulated genes were selected for further functional testing in BY-2 cell cultures using Agrobacterium-mediated gene transformation. Six genes caused a lower alkaloid accumulation compared to the control when assayed in cell cultures, whereas three genes elevated the production of one or several alkaloids. One of the genes causing enhanced alkaloid accumulation was found to possess high sequence similarity with lysine decarboxylase, a gene responsible for the conversion of lysine in early anabasine biosynthesis. However, since lysine decarboxylase activity was not shown by the corresponding protein, the exact nature of this gene requires further elucidation. The selected genes were also assayed in hairy roots, which constitutively produce alkaloids. Two highly homologous genes were found, which showed divergent effects on alkaloid biosynthesis. These genes were suggested to function in auxin homeostasis. The other gene also resulted in marked increase in nicotine accumulation. Tropane and tobacco alkaloids share a common biosynthetic origin, and therefore it was of interest to study whether Nicotiana genes could have a role in the formation of tropane alkaloids in a related species H. muticus. It was observed that the same gene which elevated nicotine contents in Nicotiana showed a positive effect on tropane alkaloid intermediate in H. muticus, suggesting a possible conserved role of this gene in Solanaceae species. On the other hand, when a known tropane alkaloid pathway gene, hyoscyamine-6β-hydroxylase (H6H), was overexpressed in N. tabacum hairy roots, a 45 % conversion of hyoscyamine into scopolamine took place when hyoscyamine was supplied to the cultures. Furthermore, up to 85 % of the produced scopolamine was secreted out of the cells. Besides being able to uptake and convert a foreign substrate, an altered tobacco alkaloid production in roots was observed after hyoscyamine feeding, suggesting highly complex regulation of the production of these defence-related compounds. In order to improve the understanding of alkaloid transport and secretion, the function of a yeast ATP-binding cassette transporter was investigated and it was shown to attribute enhanced tolerance of tropane alkaloids in N. tabacum cell cultures. Combined with the information of the regulation of the biosynthesis, transporters can be exploited to design novel tools to enhance the yield and diversity of alkaloids. en
dc.description.abstract Työn pääasiallinen tavoite oli tutkia alkaloidien biosynteesiä kahdessa Solanaceae-heimon soluviljelmässä, tupakassa (Nicotiana tabacum) ja Egyptin villikaalissa (Hyoscyamus muticus). Tupakan alkaloidibiosynteesiin osallistuvien geenien kartoitus tehtiin funktionaalisen genomiikan tekniikkaa käyttäen, jossa yhdistettiin koko genomin kattava transkriptioprofilointianalyysi cDNA-AFLP ja kohdennettu metaboliittianalyysi. Nikotiinisynteesi elisitoitiin tupakan BY-2-soluviljelmissä metyylijasmonaatilla ja tuloksena löydettiin yhteensä 459 geeniä, jotka ekspressoituivat metyylijasmonaatin vaikutuksesta. Näistä geeneistä 58 %:lla oli homologia jo tunnettujen geenien kanssa, kuitenkin 26 % geeneistä osoittautui aiemmin tuntemattomiksi, ja osan näistä geeneistä oletettiin osallistuvan tupakka-alkaloidien säätelyyn. Alkaloidien muodostuminen alkoi soluissa 12 tuntia elisitoinnin jälkeen, ja eri alkaloidit noudattivat omaa kinetiikkaansa. Anatalliinin osoitettiin esiintyvän tupakan soluviljelmissä ensimmäistä kertaa, ja se muodosti anatabiinin kanssa pääalkaloidiluokan. Lisäksi anatalliini esiintyi kahdessa eri isomeriamuodossa. Toisin kuin tupakkakasvissa, elisitoiduissa soluissa nikotiinia tuotettiin vain pieniä määriä, kun taas nikotiinisynteesin välituotetta metyyliputreskiinia muodostui suuria määriä. Tämän tuloksen perusteella nikotiinin biosynteesissä rajoittava vaihe oli jokin reaktio metyyliputreskiinin ja nikotiinin välissä. Näistä tupakasta eristetyistä geeneistä yhteensä 34 yliekspressoitiin tupakkaan agrobakteerivälitteisellä geeninsiirrolla. Alkaloidituotto oli kuudessa eri transgeenisessä viljelmässä alhaisempaa kuin kontrolliviljelmissä, kun taas kolmella eri geenillä vaikutus viljelmän alkaloidituottoon oli positiivinen. Yhdellä näistä tupakan alkaloidituottoa lisäävistä geeneistä oli yhteneväisyyttä lysiini-dekarboksylaasin kanssa, joka toimii anabasiini-alkaloidin varhaisessa biosynteesissä. Kuitenkin lysiini-dekarboksylaasin entsyymiaktiivisuutta ei havaittu, joten tämän geenin tarkempi kartoitus vaatii lisätutkimuksia. Valitut geenit yliekspressoitiin myös tupakan karvajuuriin, joissa alkaloidien tuottoon ei tarvita elisitaatiota. Näissä viljelmissä kaksi eri geeniä, jotka olivat hyvin samankaltaisia aminohappokoostumukseltaan, aiheuttivat erilaisia vaikutuksia alkaloidituottoon. Toinen geeneistä nosti merkittävästi nikotiinipitoisuuksia viljelmissä, ja näiden geenien toiminta kohdistuu todennäköisesti auksiiniaineenvaihduntaan. Tropaani- ja tupakka-alkaloidit syntetisoidaan yhteisistä lähtöaineista ja näin ollen oli kiinnostavaa selvittää, voivatko tupakan geenit toimia myös sukulaiskasvin villikaalin tropaanialkaloidi-aineenvaihdunnassa. Tutkimuksissa havaittiin, että sama geeni, joka nosti nikotiinipitoisuuksia tupakan juuriviljelmissä, aiheutti villikaalin juuriviljelmissä korkeampia tropaanialkaloidien välituotteen pitoisuuksia. Näin ollen tällä geenillä saattaa olla yleisempää vaikutusta Solanaceae-heimon aineenvaihdunnassa. Alkaloidien kuljetusta ja erittymistä tutkittiin hiivaperäisen ABC-transportterigeenin avulla. Tämän geenin todettiin lisäävän tropaanialkaloidien sietokykyä tupakan soluviljelmissä. Kun tropaanialkaloidireitin hyoskyamiinia konvergoiva geeni H6H (hyoskyamiini 6β-hydroksylaasi) yliekspressoitiin tupakan juuriviljelmissä, 45 % viljelmiin lisätystä hyoskyamiinista muuttui skopolamiiniksi. Lisäksi suuri määrä, jopa 85 % tuotetusta skopolamiinista, erittyi soluista ulos. Sen lisäksi, että nämä tupakan karvajuuret ottivat hyvin sisäänsä ja metaboloivat alustaan lisätyn vieraan substraatin, näillä juurilla havaittiin muutoksia myös tupakka-alkaloidiaineenvaihdunnassa. Tulosten perusteella näyttää siltä, että näillä puolustusreaktioissa toimivilla aineenvaihduntatuotteilla on hyvin monimutkainen säätelyjärjestelmä. fi
dc.format.extent 90, [49]
dc.format.mimetype application/pdf
dc.language.iso en en
dc.publisher VTT Technical Research Centre of Finland en
dc.publisher VTT fi
dc.relation.ispartofseries VTT publications en
dc.relation.ispartofseries 696 en
dc.relation.haspart Goossens, A., Häkkinen, S.T., Laakso, I., Seppänen-Laakso, T., Biondi, S., De Sutter, V., Lammertyn, F., Nuutila, A.M., Söderlund, H., Zabeau, M., Inzé, D. and Oksman-Caldentey, K.-M. (2003a): A functional genomics approach toward the understanding of secondary metabolism in plant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. Vol. 100. Pp. 8595-8600.
dc.relation.haspart Häkkinen, S.T., Rischer, H., Laakso, I., Maaheimo, H., Seppänen-Laakso, T. and Oksman-Caldentey, K.-M. (2004): Anatalline and other methyl jasmonate-inducible nicotine alkaloids from Nicotiana tabacum cv. BY-2 cell cultures. Planta Medica. Vol. 70. Pp. 936-941.
dc.relation.haspart Häkkinen, S.T., Tilleman, S., Šwiątek, A., De Sutter, V., Rischer, H., Vanhoutte, I., Van Onckelen, H., Hilson, P., Inzé, D., Oksman-Caldentey, K.-M. and Goossens, A. (2007): Functional characterisation of genes involved in pyridine alkaloid biosynthesis in tobacco. Phytochemistry. Vol. 68. Pp. 2773-2785.
dc.relation.haspart Häkkinen, S.T., Moyano, E., Cusidó, R.M., Palazón, J., Piñol, M.T. and Oksman-Caldentey, K.-M. (2005): Enhanced secretion of tropane alkaloids in Nicotiana tabacum hairy roots expressing heterologous hyoscyamine-6β-hydroxylase. Journal of Experimental Botany. Vol. 56. Pp. 2611-2618.
dc.relation.haspart Goossens, A., Häkkinen, S.T., Laakso, I., Oksman-Caldentey, K.-M. and Inzé, D. (2003b): Secretion of secondary metabolites by ATP-binding cassette transporters in plant cell suspension cultures. Plant Physiology. Vol. 131. Pp. 1161-1164.
dc.subject.other Biotechnology en
dc.title A functional genomics approach to the study of alkaloid biosynthesis and metabolism in Nicotiana tabacum and Hyoscyamus muticus cell cultures en
dc.title Alkaloidien biosynteesin ja metabolian tutkiminen funktionaalisella genomiikalla tupakan ja villikaalin soluviljelmissä fi
dc.type G5 Artikkeliväitöskirja fi
dc.description.version reviewed en
dc.contributor.school Faculty of Chemistry and Materials Sciences en
dc.contributor.school Kemian ja materiaalitieteiden tiedekunta fi
dc.subject.keyword alkaloids en
dc.subject.keyword biosynthesis en
dc.subject.keyword BY-2 en
dc.subject.keyword cell culture en
dc.subject.keyword functional genomics en
dc.subject.keyword hairy roots en
dc.subject.keyword Hyoscyamus muticus en
dc.subject.keyword Nicotiana tabacum en
dc.subject.keyword secondary metabolism en
dc.identifier.urn urn:nbn:fi:tkk-012649
dc.type.dcmitype text en
dc.type.ontasot Väitöskirja (artikkeli) fi
dc.type.ontasot Doctoral dissertation (article-based) en


Files in this item

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record

Search archive


Advanced Search

article-iconSubmit a publication

Browse

My Account