Mitigation of the impacts of ageing on brewer’s yeast

Abstract

Maintaining stable flavor profile in beer is crucial after the beer is stored. The storage conditions may vary greatly inducing loss of flavors and formation of undesired compounds. Yeast is a key component in brewing and potentially contributes to the flavor stability of the beer. Maintaining the yeast viable throughout the brewing process prevents the formation of off-flavors via cell lysis and/or metabolic activity. The major contributor to cellular age under non-dividing state is the accumulation of reactive oxygen species (ROS), often referred to as The Free radical theory of ageing. The major source of ROS is the mitochondria and without a sufficient antioxidant system, these radicals can cause cellular damage.

The purpose of this work was to study whether increasing yeast’s resistance to oxidative stress influences its longevity. A technique called adaptive evolution was applied to one bottom-fermenting (lager) and one top-fermenting (ale) brewing yeast strain, A15 and A224, respectively, to improve their resistance against oxidants. The yeast was adapted in seven different media including YPM and YPM supplemented with acrolein, ethanol, CuSO4, H2O2, menadione and paraquat for approximately 150 cell generations. Isolated adapted variants were then screened for resistance to these oxidants. A copper-adapted variant of A15 was found and it was shown to restrict the uptake of the metal. The original strain on the other hand accumulated quickly toxic amounts of copper. The adapted strain was also more sensitive to ethanol and grew slower in control conditions compared to the parent strain suggesting its growth is copper-limited. The copper-adapted strain was also more sensitive to chronological ageing, revealed by the longevity experiment carried out in this work.

Antioxidant analyses executed during the ageing experiments revealed that the non-enzymatic antioxidant glutathione is the first to appear and be depleted during storage in beer, but not in water. The activities of enzymatic antioxidants superoxide dismutase (SOD) and catalases increased later in the experiment. SOD activity remained relatively low in water-stored yeast while the content of catalases was not affected by the media.

Oluen makuyhdisteiden säilyvyys on elintärkeää lopputuotteessa, mutta vaihtelevat varastointiolosuhteet hankaloittavat makujen pysyvyyttä. Hiiva on yksi oluen tärkeimmistä raaka-aineista, joka tuottaa olueen maku- ja aromiyhdisteitä. Toisaalta hiivalla on mahdollisesti tärkeä rooli maun stabiiliuden kannalta, minkä vuoksi hiivan säilyvyyden parantaminen saattaa ehkäistä oluen sivumakujen muodostumista soluhajoamisen ja/tai eri metaboliareittien kautta.

Solujen ikääntymisen on arveltu johtuvan reaktiivisten happiyhdisteiden kerääntymisestä, mikä saattaa aiheuttaa solunsisäisiä vaurioita ilman riittävää antioksidanttista puolustusmekanismia. Tämä teoria tunnetaan myös nimellä Vapaiden radikaalien ikääntymisteoria (eng. Free radical theory of ageing). Pääasiallinen happiradikaalien lähde on mitokondrio.

Tämän työn tarkoitus oli tutkia, vaikuttaako hiivan oksidatiivisen stressin sietokyvyn lisääminen ikääntymiseen. Kahden panimohiivakannan, A15 ja A224, sietokykyä pyrittiin lisäämään adaptiivisella evoluutiolla, jossa hiivaa kasvatettiin seitsemällä eri liemellä sisältäen YPM-alustan sekä YPMliemen, johon oli lisätty akroleiinia, etanolia, kuparisulfaattia, vetyperoksidia, menadionia tai paraquatia noin 150 solujakautumisen ajan. Adaptiivisen evoluution jälkeen eristettyjen hiivavarianttien vastustuskyky mainittuja oksidantteja vastaan tutkittiin tehoseulonnan avulla. Tutkimuksessa löydettiin kupariresistentti variantti A15-hiivasta, jonka havaittiin jatkotutkimuksissa estävän kuparin virtauksen solun sisälle, kun taas alkuperäinen kanta akkumuloi nopeasti haitallisen määrän kuparia. Kupariadaptoituneen kannan havaittiin olevan myös herkkä etanolille ja kasvoi isäntäkantaa hitaammin kontrolliolosuhteissa, minkä todettiin viittaavaan kuparirajoitteeseen kasvuun. Ikääntymiskokeissa tämän kannan havaittiin kestävän varastointia huonommin.

Ikääntymiskokeiden yhteydessä solujen antioksidanttien, glutationin, superoksidi dismutaasin ja katalaasien, pitoisuudet määritettiin. Ei-entsymaattisen antioksidantin, glutationin, havaittiin olevan näistä kolmesta ensimmäisenä ilmestyvä ja sen havaittiin kuluvan 30 päivää kestäneen varastoinnin aikana, kun alustana käytettiin olutta. Glutationipitoisuuden havaittiin olevan suurin vedessä varastoidussa hiivassa. Entsymaattisten antioksidanttien, superoksidi dismutaasin (SOD) ja katalaasien, pitoisuudet kasvoivat vasta myöhemmin kokeen loppuvaiheessa. SOD:n konsentraatio pysyi matalana vedessä säilötyissä soluissa, kun taas katalaasien pitoisuuteen alustalla ei havaittu olevan merkitystä.