Learning Centre

Temporal control of transcription with Cas9 effectors in human cells

 |  Login

Show simple item record

dc.contributor Aalto-yliopisto fi
dc.contributor Aalto University en
dc.contributor.advisor Weltner, Jere
dc.contributor.author Salmela, Minnamari
dc.date.accessioned 2016-10-12T11:38:57Z
dc.date.available 2016-10-12T11:38:57Z
dc.date.issued 2016-10-04
dc.identifier.uri https://aaltodoc.aalto.fi/handle/123456789/22824
dc.description.abstract With the new CRISPR-Cas9 technique discovered in 2012, gene editing and modulation of transcriptional regulation is easier than ever before. Using this method, transcription can be controlled by utilizing so called Cas9 effectors, which are transcription effectors fused to a deactivated Cas9 protein. This sort of gene transcription regulation can be exploited in cell reprogramming and stem cell differentiation. Today, stem cells are widely used in biomedical research to develop in vitro disease models, regenerative therapies and new drug-screening platforms. Currently, somatic cells are primarily reprogrammed to pluripotent state by using forced overexpression of transgenic transcription factors. However, the problems with this method are poor reprogramming efficiency and the possibility of foreign gene integration into the genome, which could have oncogenic effects. Using Cas9 effectors, transcription can be activated in the actual endogenic locus and thus pluripotency gene regulatory networks can be rewired more efficiently. This leads to more efficient reprogramming. In this thesis work several transcriptional effectors were tested to see their effect on the expression of pluripotency-associated genes, mostly OCT4 and SOX2. In addition, a bidirectional regulatory system for gene expression was created and tested. In this system genes were first activated and then repressed with the aid of two small molecular compounds. Most of the transcriptional effectors were very weak on their own but fusing different effectors together resulted in significantly stronger activation. The strongest activators were VPPH and VPR, which are a combination of four and three different activators, respectively, while the KRAB repressor achieved a 40 % reduction in gene expression. With the dual system, gene expression was increased 230-fold and repressed back to basal level in six days. These preliminary results indicate the feasibility of this approach for temporal control of transcription. en
dc.description.abstract Vuonna 2012 kehitetyn CRISPR-Cas9 -tekniikan avulla geenien muokkaaminen ja säätely on helpompaa kuin koskaan ennen. Menetelmän avulla voidaan muun muassa säädellä geenin transkriptiota niin sanotuilla Cas9-efektoreilla, eli transkriptiota säätelevillä proteiineilla, jotka on yhdistetty deaktivoituun Cas9-proteiiniin. Tätä geenisäätelyä voidaan hyödyntää esimerkiksi solujen uudelleenohjelmoinnissa monikykyisiksi kantasoluiksi tai erilaistuksessa. Kantasolut ovat nykyään laajalti käytössä biolääketieteellisessä tutkimuksessa, jossa niitä käytetään esimerkiksi sairauksien mallintamiseen sekä regeneratiivisten hoitojen ja uusien lääkeseulontamenetelmien kehittämiseen. Toistaiseksi soluja uudelleenohjelmoidaan pääasiassa transgeenisten transkriptiotekijöiden pakotetun yliekspression avulla. Menetelmän ongelmia ovat kuitenkin uudelleenohjelmoinnin epätehokkuus sekä vieraiden geenien integroituminen genomiin, mikä saattaa myöhemmin johtaa syöpäkasvaimien syntyyn. Cas9-efektorien avulla transkriptio voidaan sen sijaan aktivoida solun omissa geeneissä ja siten pluripotenssigeenien säätelyverkoston uudelleenjärjestäminen on tehokkaampaa. Tämän myötä myös uudelleenohjelmointiprosessi on tehokkaampi. Tässä työssä tutkittiin erilaisten transkriptioefektorien vaikutusta eri monikykyisyyteen liitettyjen geenien, pääasiassa OCT4:n ja SOX2:n, ekspressioon. Lisäksi työssä koottiin ja testattiin kaksisuuntaista geenisäätelysysteemi, jolla geeniekspressio voitiin ensin aktivoida ja myöhemmin repressoida kahdella eri pienmolekyylillä. Suurin osa käytetyistä transkriptioefektoreista olivat yksinään vaikutukseltaan hyvin heikkoja, mutta eri aktivaattoriyhdistelmillä tulokset olivat huomattavasti parempia. Tehokkaimmat aktivaattorit olivat VPPH ja VPR, jotka koostuvat neljän ja kolmen eri aktivaattorin yhdistelmästä, ja KRAB-repressori puolestaan alensi geeniekspressiota 40 %. Geenisäätelysysteemillä geeniekspressio saatiin nousemaan 230-kertaiseksi ja palaamaan takaisin lähtötasolle kuudessa päivässä. Näiden alustavien tulosten perusteella tämä on toimiva menetelmä transkription ajalliseen säätelyyn. fi
dc.format.extent 71+29
dc.language.iso en en
dc.title Temporal control of transcription with Cas9 effectors in human cells en
dc.title Transkription ajallinen säätely Cas9-efektorien avulla ihmissoluissa fi
dc.type G2 Pro gradu, diplomityö fi
dc.contributor.school Kemian tekniikan korkeakoulu fi
dc.subject.keyword CRISPR en
dc.subject.keyword Cas9 en
dc.subject.keyword transcriptional regulation en
dc.subject.keyword stem cell en
dc.identifier.urn URN:NBN:fi:aalto-201610124924
dc.programme.major Biotekniikka ja elintarviketekniikka fi
dc.programme.mcode KE3002 fi
dc.type.ontasot Master's thesis en
dc.type.ontasot Diplomityö fi
dc.contributor.supervisor Linder, Markus
dc.programme KEM - Kemian tekniikan koulutusohjelma fi
dc.location PK fi
local.aalto.openaccess no
dc.rights.accesslevel closedAccess
local.aalto.idinssi 54656
dc.type.publication masterThesis
dc.type.okm G2 Pro gradu, diplomityö


Files in this item

Files Size Format View

There are no open access files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record

Search archive


Advanced Search

article-iconSubmit a publication

Browse

Statistics