Learning Centre

Development of immobilized enzyme microreactors for studying cytochrome P450 mediated drug metabolism

 |  Login

Show simple item record

dc.contributor Aalto-yliopisto fi
dc.contributor Aalto University en
dc.contributor.advisor Sikanen, Tiina
dc.contributor.author Kiiski, Iiro
dc.date.accessioned 2016-09-22T08:55:09Z
dc.date.available 2016-09-22T08:55:09Z
dc.date.issued 2016-09-13
dc.identifier.uri https://aaltodoc.aalto.fi/handle/123456789/22154
dc.description.abstract The cytochrome P450 (CYP) enzyme family is responsible for eliminating exogenous chemicals from the human body. As most drugs are metabolized by the same small number of CYP isoenzymes, the risk of drug-drug interactions grows as the use of drugs increases. Consequently, it is important to study the metabolic pathways of a new drug candidate as early in the development pipeline as possible to be able to either modify the molecule or abandon the candidate before continuing to the cost-intensive clinical stage. The general aim of this thesis was to develop new immobilization methods for cytochrome P450 enzymes with a view to implementation of immobilized enzyme microreactors for pharmaceutical applications. Two main approaches for immobilizing CYP-containing human liver microsomes (HLM) were studied: the immobilization of HLM on commercial streptavidin-coated magnetic particles and the immobilization of HLM on in-house fabricated thiol-ene based microfluidic chips. On the basis of literature search, a novel immobilization method utilizing biotin-labelled fusogenic liposomes (FL) was developed. When immobilizing HLM on magnetic particles, the use of FL conferred a 3-fold increase in enzyme activity compared to a previously published method based on physical adsorption on the bead surface. The Km value of the immobilized HLM was determined, and was comparable to the Km of the soluble HLM (2.5 ± 0.49 μM and 0.5-2 μM, respectively), which is essential for the prospective applications in metabolic studies. Enzyme stability remains an issue, as the activity of the immobilized enzyme quickly decreased with consecutive incubations, probably due to both thermal inactivation and leaching. Three different methods for HLM immobilization on thiol-ene micropillar chips were studied. HLM were solubilized on a chip surface functionalized with lipid bilayers and HLM labeled with biotin using FL was bound on streptavidin-functionalized chip surface. For comparison, HLM was also immobilized on chip surface by physical adsorption. The highest initial activities could be achieved by adsorption, but the activity also decreased very rapidly. With the other two methods, initial reactor activities were lower, but the decline of enzyme activity could be slowed down. However, the enzyme activity of all reactors faded within 2 hours. In the future, practical applications based on the developed immobilization approaches could be developed for in vitro studies of human drug metabolism. Another valid application for these reactors is the in situ preparation of analytical standards of CYP metabolites. en
dc.description.abstract Sytokromi P450 (CYP) entsyymiperhe vastaa vierasaineiden poistamisesta ihmiskehosta. Koska useimpien lääkeaineiden metaboliaa katalysoivat samat CYP-isoentsyymit, lääkeaineinteraktioiden riski kasvaa, kun lääkkeiden käyttö yhteiskunnassa lisääntyy. Uusien lääkeaineiden metaboliareittejä onkin tärkeää kartoittaa jo varhaisessa vaiheessa lääkekehitystä, jotta molekyyliä voidaan tarvittaessa muokata tai kehityslinja hylätä kokonaan ennen kallista kliinistä vaihetta. Tämän työn tavoitteena oli kehittää uusia immobilisointimenetelmiä CYP-entsyymeille farmaseuttisia sovelluksia varten. Työssä tutkittiin kahta menetelmää CYP-entsyymejä sisältävien ihmisen maksamikrosomien (human liver microsomes, HLM) immobilisointiin. Entsyymejä immobilisoitiin sekä kaupallisten, streptavidiinipäällysteisten magneettipartikkeleiden pintaan että itse valmistettujen tioleenipohjaisten mikrosirujen pintaan. Tarkoitukseen kehitettiin kirjallisuushaun perusteella uusi, biotiinileimattuja fusogeenisiä liposomeja hyödyntävä immobilisointimenetelmä. Fusogeenisten liposomien hyödyntäminen nosti magneettipartikkelien pintaan immobilisoitujen entsyymien entsyymiaktiivisuutta kolminkertaisesti verrattuna aikaisemmin raportoituun adsorptiopohjaiseen menetelmään. Immobilisoidulle HLM:lle määritetty Km-arvo (2.5 ± 0.49 μM) vastasi hyvin kirjallisuudessa liukoiselle HLM:lle raportoitua arvoa (0.5-2 μM), mikä on oleellista mahdollisten tulevien sovellusten kannalta. Immobilisoidun entsyymin aktiivisuus kuitenkin laski nopeasti perättäisten inkubointien seurauksena, mikä johtui todennäköisesti sekä entsyymin huuhtoutumisesta että lämmön aikaansaamasta inaktivaatiosta. Tioleenipohjaisten mikrosirujen pintaan mikrosomeja immobilisoitiin kolmella menetelmällä. Mikrosomeja liuotettiin lipidi-kaksoiskerroksella funktionalisoidun kanavan pintaan ja biotiinilla leimattuja mikrosomeja immobilisoitiin streptavidiinilla funktionalisoidun sirun pintaan. Verrokkisirussa HLM immobilisoitiin sirun pintaan fysikaalisen adsorption avulla. Suurin alkuaktiivisuus saavutettiin adsorptiolla, mutta entsyymiaktiivisuus myös laski nopeasti. Kahta muuta menetelmää hyödyntämällä alkuaktiivisuudet olivat matalampia, mutta aktiivisuus myös tippui hitaammin. Kaikkien reaktorityyppien aktiivisuus hävisi kahden tunnin sisällä reaktion aloittamisesta. Tulevaisuudessa työssä kehitettyjä immobilisointimenetelmiä voidaan käyttää pohjana suunniteltaessa käytännön sovelluksia ihmisen vierasainemetabolian tutkimiseen. Toinen mahdollinen sovelluskohde kehitetyille entsyymireaktoreille on analyyttisten metaboliittistandardien tuottaminen. fi
dc.format.extent 83 + 1
dc.format.mimetype application/pdf en
dc.language.iso en en
dc.title Development of immobilized enzyme microreactors for studying cytochrome P450 mediated drug metabolism en
dc.title Immobilisoitujen entsyymimikroreaktorien kehittäminen sytokromi P450 -välitteisen lääkeainemetabolian tutkimiseen fi
dc.type G2 Pro gradu, diplomityö fi
dc.contributor.school Kemian tekniikan korkeakoulu fi
dc.subject.keyword cytochrome p450 en
dc.subject.keyword drug metabolism en
dc.subject.keyword microfluidics en
dc.subject.keyword immobilization en
dc.identifier.urn URN:NBN:fi:aalto-201609224163
dc.programme.major Biotekniikka ja elintarviketekniikka fi
dc.programme.mcode KE3002 fi
dc.type.ontasot Master's thesis en
dc.type.ontasot Diplomityö fi
dc.contributor.supervisor Frey, Alexander
dc.programme KEM - Kemian tekniikan koulutusohjelma fi
dc.location PK fi
local.aalto.openaccess yes
dc.rights.accesslevel openAccess
local.aalto.idinssi 54397
dc.type.publication masterThesis
dc.type.okm G2 Pro gradu, diplomityö


Files in this item

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record

Search archive


Advanced Search

article-iconSubmit a publication

Browse

Statistics