Optimization of lentiviral vector production

 |  Login

Show simple item record

dc.contributor Aalto-yliopisto fi
dc.contributor Aalto University en
dc.contributor.advisor Eerikäinen, Tero
dc.contributor.advisor Heikura, Tommi
dc.contributor.author Valkama, Anniina
dc.date.accessioned 2015-12-16T07:53:17Z
dc.date.available 2015-12-16T07:53:17Z
dc.date.issued 2015-12-15
dc.identifier.uri https://aaltodoc.aalto.fi/handle/123456789/19172
dc.description.abstract Lentiviral vectors have emerged as a promising alternative in the field of gene therapy. They present a stable and efficient method for gene transfer in humans. However, production with the conventional small-scale production methods does not meet the requirements for producing large amounts of vectors required for several treatments. The aim of this study was to optimize the production of lentiviral vectors in a 4 m2 fixed-bed bioreactor with calcium phosphate transfection, clarification of the product, and concentration with tangential flow filtration. In the upstream phase, the aim was to optimize the conditions, and to find feasible working methods suitable for large-scale production. In the downstream phase, the aim was to find a feasible harvest window, and to find a suitable filter and conditions for clarification and concentration. Upstream phase performed with the conventional transfection protocol resulted in approximately 5 liters of lentiviral vector product per run with an average yield of 1.4 TU/ml. The best yield obtained with the new transfection protocol designed for large-scale operation was 1.1 TU/ml. Based on the downstream results, the optimal harvest window for an adherent fixed-bed bioreactor lentiviral vector production is three days starting from the day after transfection. For clarification, depth filters with large pore size are preferable. In this study, clarification was found to be optimal with a depth filter with pore size of 0.6 – 1.2 μm. Sterile filtration in the early downstream phase decreases the recoveries. Concentration was conducted with tangential flow filtration, and followed by diafiltration. It was observed that relatively high transmembrane pressure of 1.2 bar combined with small nominal molecular weight cutoff of 100 kDa was optimal. Suitably large filtration area is essential to reduce the operation time. Up to 44 % total recovery was achieved with the optimized methods. en
dc.description.abstract Lentiviruksia on käytetty lupaavin tuloksin vektoreina geeniterapiassa. Niiden avulla pystytään suorittamaan geeninsiirto tehokkaasti taaten siirtogeenin stabiili ilmentyminen. Perinteiset tuottomenetelmät eivät kuitenkaan ole tarpeeksi tehokkaita tuottamaan useissa geeninsiirroissa vaadittavia suuria määriä lentivirusvektoreita. Tämän tutkimuksen tarkoitus oli optimoida lentivirusvektoreiden tuotanto 4 m2:n kiinteä-petibioreaktorissa kalsiumfosfaattimenetelmää käyttäen, tuotteen esisuodatus ja konsentrointi tangentiaalivirtaussuodattimella. Tuottoprosessin parametrit ja menetelmät optimoitiin soveltumaan suuren mittakaavan tuotantoon. Jälkikäsittelyssä etsittiin sopiva aikaväli tuotteen keräykselle sekä sopivat suodattimet ja olosuhteet esisuodatukseen ja konsentrointiin. Perinteisellä menetelmällä tuotettiin noin 5 litraa tuotetta, jonka konsentraatio oli keskimäärin 1.4 infektiivistä yksikköä/ml. Uudella, suuren mittakaavan tuotantoon soveltuvalla transfektiomenetelmällä saavutettiin parhaimmillaan 1.1 infektiivistä yksikköä/ml konsentraatio. Jälkikäsittelyissä puolestaan havaittiin, että tuotteen optimaalinen keräysaika on kolme vuorokautta alkaen transfektion jälkeisestä päivästä. Esisuodatukseen soveltuvat parhaiten syväsuodattimet. Tässä tutkimuksessa optimaaliseksi havaittiin suhteellisen suuri huokoskoko 0.6 – 1.2 μm. Steriilisuodatusta jälkikäsittelyn alkuvaiheessa ei voi suositella saannon pienentymisen vuoksi. Konsentrointiin käytettiin tangentiaalivirtaussuodatusta. Konsentrointia seurasi myös diafiltrointi. Tutkimuksessa havaittiin, että tangentiaalivirtaussuodatuksessa suhteellisen korkea (1.2 bar) membraanin yli vaikuttava paine on edullinen. Lisäksi pienemmän huokoskoon (100 kDa) suodatin takasi suuremman saannon. Havaittiin myös, että tarpeeksi suuri suodatuspinta-ala on olennainen, jotta prosessiaika pysyy lyhyenä. Optimoiduilla olosuhteilla saavutettiin parhaimmillaan 44 % kokonaissaanto. fi
dc.format.extent 116 + 14
dc.language.iso en en
dc.title Optimization of lentiviral vector production en
dc.title Lentivirusvektorien tuotannon optimointi fi
dc.type G2 Pro gradu, diplomityö en
dc.contributor.school Kemian tekniikan korkeakoulu fi
dc.subject.keyword lentivirus en
dc.subject.keyword lentiviral vectors en
dc.subject.keyword fixed-bed bioreactor en
dc.subject.keyword calcium phosphate transfection en
dc.subject.keyword tangential flow filtration en
dc.subject.keyword process optimization en
dc.identifier.urn URN:NBN:fi:aalto-201512165690
dc.programme.major Biotekniikka ja elintarviketekniikka fi
dc.programme.mcode KE3002 fi
dc.type.ontasot Master's thesis en
dc.type.ontasot Diplomityö fi
dc.contributor.supervisor Ojamo, Heikki
dc.programme KEM - Kemian tekniikan koulutusohjelma fi
dc.location PK fi


Files in this item

Files Size Format View

There are no files associated with this item.

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record

Search archive


Advanced Search

article-iconSubmit a publication

Browse

My Account