Formation of synthetic organelles in Saccharomyces cerevisiae utilizing Ty1 capsid proteins

Abstract

The goal of metabolic engineering is to improve the metabolism of an organism to increase product yield and specificity. Modifying the organism’s metabolism brings up challenges, such as defects in its endogenous processes and unwanted crosstalk between pathways. To avoid this, metabolic reactions can be compartmentalized into organelles. In yeast metabolic engineering compartmentalization into native organelles has been utilized in the production of variety of bioproducts with promising results. An alternative is to compartmentalize pathways into entirely synthetic organelles. The most researched synthetic organelles, bacterial microcompartments (BMCs) and encapsulins are found in different bacteria and archaea, and they consist of a proteinaceous shell with semipermeable pores enabling the influx and outflux of molecules.BMCs encapsulins have been successfully used as nanofactories to house enzymatic reactions. An alternative would be to use an endogenous structure, such as the virus-like particle (VLP) formed of transposons of yeast (Ty) capsid proteins. The aim of this thesis work was to investigate the potential of VLPs formed of the Ty1 capsid protein p2 as synthetic organelles in yeast Saccharomyces cerevisiae. Recombinant S. cerevisiae strains were created containing the p2 fused together with a model protein, green fluorescent protein (GFP) and only GFP. The strains were analysed by creating four sample fractions of the cell lysis to determine the assembly of the capsid proteins as VLPs. P2 proteins alone and fused with GFP were found to assemble as VLPs. GFP expression was measured in continuous 24-hour experiments first with repression and then starvation. GFP was found to be expressed differently in the VLP and cytosol. The particles were found to remain stable under starvation.

Organismin aineenvaihdunnan muokkaamisen tavoitteena on korkeamman saannon ja tarkemman tuotespesifisyyden saavuttaminen. Aineenvaihdunnan muokkaaminen tuo esiin haasteita, kuten puutteita solujen luonnollisissa prosesseissa ja eri aineenvaihduntapolkujen risteämistä. Tämän välttämiseksi aineenvaihduntareaktioita voidaan siirtää lokeroihin, eli organismin soluelimiin. Hiivan aineenvaihduntaa on muokattu lupaavin tuloksin siirtämällä eri aineenvaihduntareaktiota sen luonnollisiin soluelimiin, ja näin on tehostettu erilaisten biotuotteiden tuotantoa. Vaihtoehto solun luonnollisille soluelimille ovat synteettiset soluelimet, kuten bakteerien mikrolokerot (bacterial microcompartment, BMC) and enkapsuliinit. Ne koostuvat proteiineista muodostuvasta puoliläpäiseviä huokosia sisältävästä kuoresta, joka mahdollistaa molekyylien virran sisään ja ulos. BMC:tä ja enkapsuliineja on onnistuneesti hyödynnetty entsymaattisten reaktioiden suorittamiseen hiivoissa. Synteettisenä soluelimenä voidaan myös käyttää sisäistä rakennetta, kuten viruksentapaista partikkelia (virus-like particle, VLP), joka muodostuu hiivan transposonien (transposons of yeast, Ty) kuoriproteiineista. Tämän diplomityön tarkoituksena oli tutkia mahdollisuutta käyttää natiivin transposonin Ty1 kuoriproteiinin p2 muodostamia viruksentapaisia partikkeleja synteettisinä solueliminä Saccharomyces cerevisiae -soluissa. Tätä varten luotiin kaksi rekombinanttia S. cerevisiae solukantaa: toisessa p2-proteiini yhdistettynä vihreään fluoresoivaan proteiiniin (green fluorescent protein, GFP) ja toisessa pelkkä GFP. Solukannat analysoitiin luomalla 4 näytefraktiota, joiden avulla selvitettiin, oliko proteiini partikkelimuodossa. Pelkkien p2-proteiinien ja p2-GFP-yhdistelmäproteiinin todettiin muodostavan viruksentapaisia partikkeleja. Partikkelien stabiiliutta tutkittiin jatkuvilla 24 h fluoresenssimittauksilla mittaamalla repressoituja soluja ja soluja ilman energianlähdettä. GFP ilmeni eri tavalla solulimassa ja VLP:n sisällä. Partikkelit pysyivät stabiileina ilman energianlähdettä.