In situ chitosan formation in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Chitosan, a deacetylated derivative of chitin, has many useful attributes, including antimicrobial properties, chelating capabilities, and biocompatibility, which makes it attractive for different industries. Current, most used chitosan production methods involve the use of harsh chemicals and lack control over deacetylation, resulting in inconsistent product quality. Enzymatic deacetylation of chitin using chitin deacetylases (CDAs) allows for manufacturing of chitosan with more uniform properties, but the performance of enzyme extracts is not at a feasible level. Fungal chitosan has attracted interest as an eco-friendly alternative to the traditionally produced chitosan that is manufactured from crustacean chitin, and promising results have been achieved with CDA producing fungi. Biotechnology can provide means for enhanced production of fungal chitosan. In this thesis work, inducible expression of recombinant CDA genes CDA1 and CDA2 in Saccharomyces cerevisiae was studied with colorimetric chitosan assays. The objectives were to produce chitosan by introducing recombinant CDA genes under inducible galactose promoter in vegetative cells, and to develop colorimetric quantification method for cellular chitosan providing a relatively rapid and straightforward procedure for later research. Two different assays were developed using two different dyes: one utilizing the capability of bromocresol purple to form stable dye-matrix complexes with chitosan, and other utilizing eosin Y that stains cell wall chitosan. According to the results of eosin Y assay, the best performing recombinant strain expressed CDA1 and produced approximately 0.0032 ng/cell chitosan, with production increasing with the concentration of galactose used to induce the expression of the CDA genes. However, further research is needed to be able to conclude if these colorimetric methods can be reliably used for quantification of cell wall chitosan content.

Kitosaanilla, kitiinin deasetyloituneella johdannaisella, on monia hyödynnettäviä ominaisuuksia, mukaan lukien sen antimikrobisiset ominaisuudet, kelatointikyky ja biokompatibiliteetti. Näiden ominaisuuksien vuoksi kitosaanille on kysyntää eri teollisuudenaloilla. Tällä hetkellä yleisimmissä tavoissa tuottaa kitosaania on haittapuolina voimakkaiden kemikaalien käyttö, sekä kemiallisen deasetyloinnin heikosta kontrolloitavuudesta johtuva lopputuotteen epätasainen laatu. Kitiinin etsymaattinen deasetylointi kitiinideasetylaasien (CDA) avulla mahdollistaa tasalaatuisemman tuotannon, mutta entsyymiekstraktit eivät ole tarpeeksi tehokkaita teollisen mittakaavan kitosaanintuotantoon. Sienien kitosaani on herättänyt kiinnostusta ympäristöystävällisenä vaihtoehtona kemiallisesti merenelävien kitiinikuorista tuotetulle kitosaanille, ja CDA:ta tuottavilla sienillä on saatu lupaavia tuloksia. Sienten kitosaanintuotantoa voidaan edelleen parantaa bioteknologian keinoin. Tässä diplomityössä tutkittiin rekombinanttien CDA-geenien indusoitavaa ekspressiosta Saccharomyces cerevisiae -soluissa kolorimetrisillä kitosaanimäärityksillä. Tavoitteina oli tuottaa kitosaania hiivasoluihin lisättyjen galaktoosilla indusoitavien CDA-geenien (CDA1 ja CDA2) avulla, sekä kehittää nopea ja yksinkertainen kolorimetrinen kvantifiointimetodi solusitoiselle kitosaanille myöhempää tutkimusta varten. Kaksi eri määritysmetodia kehitettiin kahdella eri väriaineella: ensimmäinen metodi hyödyntää bromkresolipurppuran ominaisuutta muodostaa stabiileja väriaine-matriisikomplekseja kitosaanin kanssa, ja toisessa metodissa hyödynnetään eosiini Y:tä, joka värjää soluseinän kitosaania. Eosiini Y -määrityksen mukaan eniten kitosaania, noin 0.0032 ng/solu, tuotti CDA1-geeniä kantava linja, ja tuotanto lisääntyi kasvavan galaktoosikonsentraation mukana. Lisätutkimuksia tarvitaan, jotta voidaan todentaa kehitettyjen kolorimetristen metodien luotettavuus.