Genotype-to-phenotype changes of SARS-CoV-2

Abstract

Three highly epidemic human coronaviruses have emerged within the last two decades. The latest one causing a COVID-19 pandemic emerged in Wuhan, China in December 2019. This previously unknown causative virus was later named as severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Over 185 million cases and 4 million deaths have been confirmed worldwide so far, and the number of cases and deaths is still rising. Not all molecular mechanisms underlying the pathogenesis of the SARS-CoV-2 have fully been revealed, and understanding the detailed molecular mechanisms is needed for developing better, faster and higher capacity diagnostics, effective vaccines and specific antiviral therapeutics against SARS-CoV-2. It is also of importance to employ whole genome sequencing data to analyse the effect of sequence variability on the pathogenesis of different sub-lineages of SARS-CoV-2 to get knowledge supporting evidence-based preparedness and prevention of the new waves of the pandemic.

The aim of this thesis was to match the phenotype to genotype of the circulating strains in Finland, and to study the infectivity and replication efficiency of the different sub-lineages of SARS-CoV-2 during the epidemic waves. Four circulating virus strains in Finland from years 2020–2021 were isolated from the patient samples and grown as virus stocks. The infectivity of these strains was modelled in human lung epithelial cell line (Calu-3) as well as in African green monkey kidney epithelial cell line transduced to express transmembrane serine protease 2 (VE6-TMPRSS2), a co-receptor of SARS-CoV-2. The virus replication efficiencies on the viral RNA and protein levels in the infected cells as well as on the newly produced virions from the culture media were compared. Two isolates, Fin3 and Fin22, carried only a few mutations in their whole genome sequences. Two other strains were a Beta (Fin32) and an Alpha (Fin34) variant, which had several mutations in their S gene among the others.

Slight differences between the strains were seen on viral RNA expression, viral protein production and new virus production levels. However, the results did not reveal any significant differences in SARS-CoV-2 replication in the studied cell models between the strains from early stage of COVID-19 and the variants carrying multiple mutations. The used protocols can be employed for studying the newly emerging variants and their characteristics to continue discovering the genotypic and phenotypic changes. After studying the genotypic changes of SARS-CoV-2 and the infectivity and replication kinetics in different cell models, the future research could focus on the mechanisms of SARS-CoV-2 to affect host immune responses, and further on interventions to combat the infection.

Viimeisen kahden vuosikymmenen aikana kolme koronavirusta on tartuttanut väli-isännän kautta ihmisen ja aikaansaanut epidemian. SARS-CoV-2-virus aiheutti COVID-19-pandemian, joka sai alkunsa Kiinasta joulukuussa 2019. Tauti on aiheuttanut jo yli 185 miljoonaa todennettua tautitapausta ja yli 4 miljoonaa kuolemaa maailmanlaajuisesti. Kaikkia molekyylimekanismeja SARS-CoV-2:n patogeenisuuden taustalla ei vielä tunneta. Näiden mekanismien ymmärtäminen on välttämätöntä, jotta voidaan kehittää parempaa diagnostiikkaa, rokotteita ja antiviraalisia lääkkeitä virusta vastaan. Myös analysoimalla kokogenomisekvensointidataa voidaan ymmärtää viruksen eri sukujuurten sekvenssien vaihtelevuuden ja muuntumisen vaikutus patogeneesiin. Tällöin voidaan myös lisätä valmiutta ja ennaltaehkäisyä pandemian uusiin aaltoihin.

Tämän työn tavoitteena oli tutkia, miten Suomessa kiertävien viruskantojen genotyypin muutokset vaikuttavat viruksen fenotyyppisiin ominaisuuksiin eri epidemia-aaltojen aikana. Neljä viruskantaa vuosilta 2020–2021 eristettiin potilasnäytteistä ja kasvatettiin virusstokeiksi. Näiden kantojen infektiivisyyttä mallinnettiin ihmisen keuhkoepiteelisolulinjassa (Calu-3) ja vihermarakatin munuaiskudoksesta johdetussa solulinjassa (Vero E6), joka on transduktoitu ilmentämään transmembraanista seriiniproteaasi 2:ta (TMPRSS2). Viruskantojen replikaatiota tutkittiin ja vertailtiin virus-RNA:n, virusproteiinin ja uuden kasvumediaan tuotetun viruksen määrän tasolla. Fin3- ja Fin22-isolaateilla oli vain muutamia mutaatioita kokogenomisekvensseissään, kun taas Beeta (Fin32) ja Alfa (Fin34) -varianteilla oli useampia mutaatioita, etenkin S-geenissä.

Kantojen välillä oli nähtävissä pieniä eroja virus-RNA:n ilmentymisessä, ja virusproteiinien sekä uuden viruksen tuottamisessa. Tulokset eivät kuitenkaan näyttäneet merkittävää eroa SARS-CoV- 2:n replikaatiossa tutkituissa solumalleissa eri kantojen kesken. Käytettyjä protokollia voi hyödyntää uusien varianttien ja niiden ominaisuuksien tutkimisessa. Tulevaisuudessa tutkimus voisi keskittyä mekanismeihin, joilla SARS-CoV-2-virus vaikuttaa isännän immuunivasteeseen, ja siitä edelleen virusinfektion kukistamiseen.