[dipl] Teknillinen korkeakoulu / TKK

Permanent URI for this collectionhttps://aaltodoc.aalto.fi/handle/123456789/40621

Browse

Browsing [dipl] Teknillinen korkeakoulu / TKK by Degree programme/Major subject "Biokemia ja mikrobiologia"

Filter results by typing the first few letters
Now showing 1 - 20 of 74
  • Ultrasuodatus monoklonaalisten vasta-aineiden konsentroinnissa ja puskurin vaihdossa
    (2005) Jänkä-Mäntynen, Heli
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
    Konsentrointi ja puskurinvaihto ovat olennainen osa monoklonaalisten vasta-aineiden jälkikäsittelyä. Konsentroinnilla parannetaan vasta-aineiden stabiilisuutta, sillä useat proteiinit ovat epästabiileja laimeissa liuoksissa. Vasta-aineliuoksen säilyvyyteen vaikuttaa oikein valittu puskuri. Rakenteeltaan samanlaiset vasta-aineet eroavat usein toisistaan muilta ominaisuuksiltaan, kuten varauksiltaan, ja käyttäytyvät siten eri tavalla eri puskureissa. Tämän työn tavoitteena oli löytää nykymenetelmää nopeampi ja kustannustehokkaampi menetelmä vasta-aineiden konsentrointiin ja puskurin vaihtoon. Tutkittavana menetelmänä oli ultrasuodatus, jonka teoriaa tarkasteltiin kirjallisuusosiossa. Kokeellinen osio koostui kolmesta osiosta; moduulin valinnasta, optimoinnista ja validoinnista. Moduulin valinta-osiossa testattiin neljää eri ultrasuodatusmoduulia, kolmea kasettimoduulia ja yhtä onttokuitumoduulia. Testatut kalvomateriaalit olivat regeneroitu selluloosa, polysulfoni ja polyeetterisulfoni. Kokeiden perusteella tarkasteltavaksi valittiin kasettimoduuli, jonka kalvomateriaalina oli regeneroitu selluloosa. Moduulin toiminta optimoitiin ja validoitiin. Kasettimoduulilla suoritettujen vasta-aineiden konsentrointi- ja puskurinvaihtokokeiden tuotteita tarkasteltiin laadun ja saannon kannalta. Vasta-aineiden laadussa ei havaittu muutoksia perinteisellä menetelmällä jälkikäsiteltyihin tuotteisiin nähden. Myös saanto oli hyvä. Menetelmänä ultrasuodatus oli huomattavasti nopeampi ja myös kustannustehokkaampi menetelmä kuin perinteinen menetelmä: Tuote valmistui kaksi vuorokautta aiemmin kuin perinteisellä menetelmällä jälkikäsitelty tuote.
  • p53-geenin mutaatioiden tutkiminen: Kapillaari-SSCP -menetelmän vertaaminen DGGE -menetelmään ja suoraan sekvensointiin
    (2003) Holmila, Reetta
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
    Geenien toimintaa muuttavien pistemutaatioiden tunnistamisesta on tullut yhä tärkeämpää biologisessa tutkimuksessa. Yksi tärkeimpiä tutkimusalueita on syöpätutkimus, jossa pyritään selvittämään miten mutaatiot vaikuttavat syövän kehitykseen. On osoitettu, että useissa ihmisen syövissä tapahtuva p53-kasvurajoitegeenin mutatoituminen on keskeisessä osassa syövän kehitystä. p53-kasvurajoitegeenin eri mutaatiotyyppien ja niiden kerääntymisen tietyille alueille uskotaan voivan viitata mutaatiot aiheuttaneisiin altisteisiin. Perinteisesti PCR-pohjaisissa mutaatioanalyysimenetelmissä on käytetty geelielektroforeesia erottamaan mutaatiot villityypeistä. Denaturant gradient gel electrophoresis (DGGE) ja single strand conformation polymorphism (SSCP) ovat molemmat tällaisia laajasti käytössä olevia menetelmiä. DGGE:tä on pidetty vaivalloisempana mutta mutaatioita herkemmin tunnistavana menetelmänä kuin SSCP:tä, joka taas on yksinkertaisuutensa vuoksi käytetympi näistä kahdesta menetelmästä. Kapillaarielektroforeesitekniikan käyttöönoton mahdollistuminen SSCP:ssä on merkittävästi parantanut menetelmän herkkyyttä ja luotettavuutta mutaatioiden havaisemisessa. Tässä työssä tutkittiin p53-geenin mutaatioita eksoneissa 5-9 keuhkosyöpänäytteistä ja verrattiin toisiinsa perinteistä DGGE:tä, kapillaarielektroforeesilla suoritettavaa SSCP:tä ja suoraa sekvensointia tarkoituksena selvittää automatisoidun kapillaarielektroforeesin edut ja herkkyys verrattuna muihin menetelmiin. Näytteitä oli 20, joista 17 sisälsi mutaation. Näistä DGGE:llä todettiin 15 (88 %), kapillaarielektroforeesi-SSCP:llä 16 (94 %) ja sekvensoinnilla 12 (71 %). Toinen DGGE:llä havaitsematta jääneistä mutaatioista sijaitsi intronissa eikä varsinaisesti tutkittavalla alueella. Kapillaarielektroforeesilla suoritettava SSCP ja DGGE vaikuttavat siis tämän tutkimuksen perusteella olevan yhtä herkkiä menetelmiä, tosin SSCP:n herkkyyttä voitaisiin todennäköisesti edelleen parantaa käyttämällä eri analyysilämpötiloja. Suoran sekvensoinnin herkkyys jäi selvästi heikommaksi kuin kummankaan seulontamenetelmän mutta se on kuitenkin ainoa menetelmä, joka kertoo myös mutaatioiden paikan ja emäsmuutoksen. Kapillaarielektroforeesilla suoritettavan SSCP:n etuja DGGE:hen verrattuna ovat menetelmän yksinkertaisuus, automatisoituvuus ja tulosten käsittelyn helppous. Kapillaarielektroforeesilla suoritettavassa SSCP:ssä voidaan myös ajo-olosuhteita muuttaa nopeasti tarpeen mukaan ja yksittäisen näytteen uusiminen on helppoa. Ajojen välinen vaihtelevuus on pieni, toisin kuin DGGE:ssä, jossa geelit valetaan joka ajoa varten erikseen. Tämän työn tuloksien perusteella kapillaarielekroforeesilla suoritettava SSCP soveltuu hyvin p53-mutaatioiden seulontaan.
  • Association study on 25 candidate genes with hip osteoarthritis
    (2009) Näkki, Annu
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
  • Biocides: Challenges and feasibilities for future development
    (2009) Soirinsuo, Kaisa
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
  • Bioinformatics tools for gene expression database
    (2005) Vaheri, Niina
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
    Diplomityö suoritettiin osana Biomedicum Bioinformatics Unit:in (BBU) Xpressionist tietokantajärjestelmän kehitysprojektia. Xpressionist tietokantajärjestelmä on suunniteltu helpottamaan Biomedicum:in tutkijoiden geenisirukokeiden mittaustuloksista keräytyvän erittäin suuren tietomäärän tallentamista ja hallintaa. Työn tarkoituksena oli laajentaa Xpressionist tietokantajärjestelmää uusilla toiminnoilla ja työkaluilla. Työn kirjallisuusosassa on esitelty bioinformatiikka tieteenalana, sen tehtävät ja biologiset sovellukset. Myös geenisirukokeita, niiden tarkoitusta ja suoritusta on kuvailtu. Lopuksi on esitelty tietokantajärjestelmiä ja biologisia ontologioita. Työn kokeellisessa osassa kehitettiin Xpressionist tietokantajärjestelmään uusia toimintoja ja työkaluja. Työ voidaan jakaa neljään kokonaisuuteen: 1) valmiina olevan tiedontuontityökalun laajentamiseen uusilla toiminnoilla, jotka mahdollistavat tutkijoiden omien geenisirukoetulosten tallennuksen tietokantaan, 2) tietokannan tietojen kuvausten yhtenäistämiseen ja standardoimiseen eVOC ontologian avulla, 3) tiedonvientityökalun kehitykseen tiedon keräyksen tietokannasta ja sen tulostuksen analyysiin sopivassa muodossa mahdollistamiseksi sekä 4) biologisten analyysityökalujen liittämiseen Xpressionist tietokantajärjestelmän yhteyteen. Työn kokeellisessa osassa käytettiin Delphi 7 ohjelmointiympäristöä uusien työkalujen ja toimintojen kehitykseen sekä SQL-kieltä tietokannan muokkaamiseen. Analyysityökalujen liittämisessä hyödynnettiin avoimen lähdekoodin Bioconductor analyysityökaluja, XML kuvauskieltä sekä internet sovelluksiin suunniteltua SOAP protokollaa. Kehitetyt uudet työkalut ja toiminnot saattoivat Xpressionist tietokantajärjestelmän tilaan, jossa käyttäjä voi sekä tallettaa geenisirukokeiden tuloksia Xpressionist tietokantaan että hakea tehokkaasti oleellista tietoa tietokannasta ja analysoida sitä tietokantaan liitetyillä työkaluilla. Seuraavana vaiheena Xpressionist tietokantajärjestelmän kehityksessä on järjestelmän julkaisu koekäyttöön pienelle käyttäjäryhmälle parannusehdotuksia varten.
  • Viljan rasvojen biologinen modifiointi
    (2002) Sippola, Soili
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
  • Slovakiasta eristettyjen rokoteperäisten poliovirusten antigeenisten ja biologisten ominaisuuksien karakterisointi
    (2008) Laine, Irina
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
    Kahden tehokkaan rokotteen (IPV ja OPV) ansiosta polio on saatu lähes häviämään maailmasta. WHO on käynnistänyt vuonna 1988 kampanjan polion eradikoimiseksi maailmasta kokonaan. Uutena ongelmana ovat tulleet esiin OPV-rokotteesta lähtöisin olevat muuntuneet rokoteperäiset poliovirukset, VDPV:t. VDPV:itä on tavattu ihmisistä toiseen siirtyvinä kiertävinä cVDPV:inä ja immuunipuutteisilla henkilöillä esiintyvinä iVDPV:inä. Nämä rokoteperäiset virukset ovat usein saaneet takaisin villityypin polioviruksen halvausta aiheuttavia sekä muita ominaisuuksia. Tässä työssä tutkittiin Slovakiassa jätevedestä eristettyjen serotyypin 2 rokoteperäisten poliovirusten (VDPV) ominaisuuksia ja rokotettujen suojaa viruksia vastaan. Antigeenisia ominaisuuksia selvitettiin ELISA- ja sekvenssianalyyseillä sekä määrittämällä IPV- ja OPV- rokotettujen henkilöiden vasta-ainetasoja viruksia vastaan. Tutkittiin myös virusten infektiokinetiikkaa, virusten soluissa indusoimia kuolinmekanismeja ja infektioprosentteja sekä kroonisen infektion syntymistä GMK- ja CaCo-2-soluviljelmissä. Lisäksi sekvenssianalyyseissä tarkasteltiin mutaatioiden jakautumista genomissa, fylogeneettisia suhteita, konservoituneita muutoksia VP1-kapsidiproteiinissa ja yhtäläisyyksiä muiden enterovirusten kanssa. Slovakian rokoteperäisten poliovirusten havaittiin olevan antigeenisilta ominaisuuksiltaan poikkeavia. OPV-rokotettujen henkilöiden vasta-ainetasojen todettiin alentuneen rokotevirukseen nähden, mutta kaikilta rokotetuilta löydettiin viruksia neutraloivia vasta- aineita. Virusten neurovirulenttisuuden tiedettiin kasvaneen ja tämä vastasi myös sekvenssianalyysissä saatuja havaintoja VP1143 ja 5'UTR481 -genominkohdista. Virusten lisääntymispotentiaali oli kasvanut ja tämä havaittiin rokotevirusta korkeampina virustuottoina. Poliovirusten translaatioon vaikuttavalta IRES-alueelta löydettiin useita mutaatioita villityypin viruksen suuntaan. VDPV:illä (isolaatti SVK 783) ei havaittu sekvenssinalueiden vaihtumista (rekombinaatio) muiden rokotevirusten tai ryhmän C enterovirusten kanssa. Saatujen havaintojen perusteella voidaan olettaa, että viruksen erittäjä on todennäköisesti immuunipuutteinen henkilö. Slovakian terveysviranomaisten suorittamissa seulonnoissa tällaista henkilöä ei ole kuitenkaan tavoitettu. Tutkimalla rokoteperäisiä polioviruksia pyritään kartoittamaan niiden aiheuttamia riskejä rokotekattavuuden alentuessa ja kehittämään strategiaa ja toimivampia rokotteita polion eradikaation loppuvaiheisiin. Tavoitteena on myös kehittää tarkempia menetelmiä rokoteperäisten poliovirusten tunnistamiseen.
  • Lipoksygenaasien valkaisuominaisuuksien karakterisointi
    (2008) Mäenpää, Maija Katariina
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
    Lipoksygenaasi (EC 1.13.11.12 Linoleate: oxygen oxidoreductase) -entsyymejä ja niiden valkaisureaktioita on tutkittu erittäin paljon. Kirjallisuudessa ei kuitenkaan aiemmin ole tehty vertailevaa tutkimusta usealla eri lipoksygenaasilla (LOX). LOX:eilla on teollisuudessa monia mielenkiintoisia käyttökohteita, joissa ne voisivat korvata valkaisureaktioissa käytettyjä kemikaaleja. LOX katalysoi primäärireaktiona 1,4-pentadieeni rakenteen sisältävien rasvahappojen hapettumista hydroperoksideiksi. Jos reaktioseoksessa on beta-karoteenia tai muuta väriyhdistettä, voi tapahtua valkaisureaktio. Tämän työn tarkoituksena oli karakterisoida ja vertailla eri lähteistä eristettyjen LOX:ien valkaisureaktiota käyttäen malliaineina beta-karoteenia, riboflaviinia ja melaniinia. Lisäksi pyrittiin selvittämään valkaisureaktion mekanismia. Tutkitut herne ja ohra kuivafraktioitiin (VTT) ja LOX:t uutettiin puskurilla. Soijan ja perunan LOX:t olivat kaupallisia valmisteita. Valkaisureaktiota tutkittiin kolmen substraatin: linolihapon, väriyhdisteen ja hapen funktiona. Perunan LOX oli vertailun tehokkain valkaisija: Samalla LOX-aktiivisuudella saavutettiin muita vertailtuja LOX:ja suurempi valkaisureaktion nopeus. Herneen LOX:lla saavutettiin huomattavasti suurempia beta-karoteenin valkaisureaktion nopeuksia kuin soijan ja ohran LOX:eilla. Linolihapon ja beta-karoteenin lähtökonsentraatiot vaikuttivat merkittävästi valkaisureaktion nopeuteen. Tutkituista LOX:eista vain soijan LOX valkaisi riboflaviinia. Riboflaviinin ja beta-karoteenin valkaisureaktion mekanismi on erilainen: beta-karoteeni hapettuu ja riboflaviini pelkistyy valkaistuessaan. Riboflaviinin valkaisureaktio on ilmeisesti pH-riippuvainen. Beta-karoteenin ja riboflaviinin valkaisureaktion nopeus kasvoi LOX-aktiivisuuden kasvaessa. Melaniinia ei valkaissut mikään tutkituista LOX:eista. Herneen, ohran ja perunan LOX:eilla valkaisureaktio pH:ssa 6 (optimi-pH) oli huomattavasti nopeampi tilanteessa, jossa happi oli kulunut linolihapon hapetusreaktiossa ennen beta-karoteenin lisäämistä kuin valkaisureaktio hapen läsnä ollessa. Soijan LOX:n katalysoimat beta-karoteenin ja riboflaviinin valkaisureaktiot pH:ssa 9 (optimi-pH) olivat suunnilleen yhtä nopeita hapen läsnä ollessa ja tilanteessa, jossa happi oli kulunut linolihapon hapetusreaktiossa. Tutkimuksessa osoitettiin, että LOX:ien katalysoima valkaisureaktio ei ole riippuvainen linolihapon hapetusreaktiosta, vaan hapetusreaktiossa muodostuneista hydroperoksideista.
  • A chimeric receptor based antibody selection and production method in mammalian cells
    (2002) Pihkala, Päivi
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
  • Leipomojätevesien puhdistustekniikoiden vertaileva tutkimus
    (2003) Antas, Bettina
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
  • Lääkeresistenssin toteaminen Mycobacterium tuberculosis -bakteerilla. Menetelmällinen vertailu
    (2002) Ådjers-Koskela, Kati
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
  • Kahden monialukkeisen PCR-menetelmän ja hippuraattitestin vertailu Campylobacter jejuni ja C. coli -lajien määrityksessä
    (2006) Koivumäki, Anna
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
    Työn tarkoituksena oli saada tietoa humaani-infektioita aiheuttaneiden kampylobakteerien lajeista. Työssä pystytettiin kaksi erilaista monialukkeista PCR-menetelmää kampylobakteerilajien tunnistamista ja erottamista varten. Kampylobakteerit ovat yleisimpiä suolistoinfektioiden aiheuttajia. Ne ovat gramnegatiivisia, itiöimättömiä ja liikkuvia bakteereja, joilla on matala G + C pitoisuus ja mikroaerobiset kasvuvaatimukset. Tartunnan voi saada vaillinaisesti kypsennetystä eläinperäisistä elintarvikkeista, pilaantuneesta vedestä tai läheisestä kontaktista eläimen kanssa. Tautiin liittyy ripuli sekä korkea kuume ja kovat vatsakivut, jotka helpottavat 3-4 päivän jälkeen. Jälkitautina voi ilmetä muun muassa reaktiivista niveltulehdusta. Yleisimmät ihmisille infektioita aiheuttavat lajit ovat C. jejuni (90-95 %) ja C. coli (5-10 %). Termofiiliset kampylobakteerit voidaan eristää kasvattamalla niitä mikroaerobisissa olosuhteissa 42 °C:n lämpötilassa. Kampylobakteerit voidaan tunnistaa pesäkkeen ulkonäön, oksidaasitestin ja gramvärjäyksen avulla. Hippuraattitesti on yleisimmin käytetty menetelmä C. jejuni -lajin erottamiseen muista kampylobakteerilajeista. Osalla C. jejuni -kannoista hippuraattitestin tulos on kuitenkin poikkeuksellisesti negatiivinen. Työssä pystytettiin kaksi erilaista monialukkeista PCR-menetelmää. Lajispesifiseen ceuE -geeniin perustuvalla menetelmällä voitiin tunnistaa C. jejuni ja C. coli -lajit. Useaan eri geeniin perustuvalla viiden lajin menetelmällä voitiin tunnistaa näiden kahden lajin lisäksi C. fetus, C. lari ja C. upsaliensis. Menetelmiä testattiin 150 potilaskannalla, joista 100 oli hippuraattinegatiivisia ja 24 hippuraattipositiivisia. Lisäksi mukana oli 26 kantaa, joiden hippuraattitestin tulos oli epäselvä heikosti positiivinen. Kaikki hippuraattipositiiviset lajit todettiin PCR-menetelmillä C. jejuni -kannoiksi. Hippuraattinegatiivisista kannoista 63 oli C. coli -kantoja ja 36 C. jejuni - kantoja. Yksi kannoista osoittautui C. fetus -lajiksi. Hippuraattitestissä heikon positiivisen tuloksen antaneista kannoista osoittautui C. jejuni -kannoiksi vain osa (5/8). Työn tulokset osoittavat, että hippuraattitesti ei yksin riitä kampylobakteerien luotettavaan lajinmääritykseen, vaan kaikkien hippuraattinegatiivisten ja heikon positiivisen tuloksen antaneiden kantojen laji tulisi varmistaa esimerkiksi PCR-menetelmällä. Viiden lajin menetelmä oli parempi kuin ceuE -geeniin perustuva menetelmä, koska sillä saatiin tulos kaikista kannoista. Menetelmän etuja olivat myös sisäisenä kontrollina toimiva 23S rRNA-fragmentti, mahdollisuus tunnistaa useampi laji sekaviljelmästä sekä viiden kampylobakteerilajin tunnistaminen.
  • Competitor Analysis of Dry Powder Inhalers in the US Market - Case Study: Pulmicort Turbuhaler
    (2002) Bergius, Susanne
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
    Tämän työn tarkoituksena oli selvittää jauheinhalaattoreiden markkinatilannetta USA:ssa. Tutkittiin useita eri tekijöitä, jotka vaikuttavat tuotteen menestykseen lanseerauksessa uudelle markkina-alueelle. Työn kirjallisuusosassa perehdyttiin astmaan, astman syihin sekä lääkitykseen. Tutustuttiin myös inhalaatioterapiaan astman hoidossa ja inhalaatiolaitteita koskeviin kysymyksiin. Tutkittiin myös USA:n inhalaattorimarkkinoita sekä alueen tärkeimpiä markkina-ajureita. Esiteltiin myös kilpailija-analyysin teoriaa, jota käytettiin perustana tutkimukselle. Empiirinen tutkimus tehtiin tapaustutkimus menetelmällä. Valittu jauheinhalaattori oli AstraZenecan Pulmicort Turbuhaler , joka on kortikosteroidi tuote. Tuoteanalyysissä tutkittiin laitteen toiminnallisuutta, kauppamerkki kysymyksiä ja tuotteen kilpailijoita. Yritysanalyysissä tutkittiin asioita, jotka koskettivat yritystä tuotteen lanseerauksen aikana USA:n markkinoille ja tämän jälkeen. Samalla arvioitiin ympäristötekijöitä, jotka koskettavat kaikkia yrityksiä samalla alalla. Pulmicort Turbuhalerilla oli joitakin ongelmia uudelle markkina-alueelle astumisen aikana. Myynnin hidas kasvu johtui tuotannon rajoituksista ja ongelmista viranomaisten kanssa. USA:n markkinat ovat hyvin kilpailulliset ja tulevaisuus tulee varmasti olemaan vaativa Pulmicort Turbuhalerille. Tuotteella on kuitenkin tiettyjä kilpailuetuja muihin vastaaviin tuotteisiin verrattuna. Yrityksen markkinointivoimilla on suuri merkitys tuotteen menestymiselle. Suurimmat tulevaisuuden uhat ovat geneerinen kilpailu ja yhdistelmävalmisteet.
  • Itiöivien sekä biofilmiä muodostavien bakteerien hallinta kartonkikoneella
    (2002) Markkula, Karoliina
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
  • Luomuelintarvikkeiden kustannusrakenne ja hinnoittelu
    (2002) Kauppi, Jussi-Pekka
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
  • Bordetella pertussis -bakteerin kasvatus ja antigeenien karakterisointi
    (2003) Suurseppä, Paula
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
  • Bakteerien toteaminen virtsasta
    (2004) Tomperi, Tiina
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
    Työn tarkoituksena oli kartoittaa pikamenetelmiä bakteerien toteamiseksi ja Gram-positiivisten ja -negatiivisten bakteerien erottelemiseksi nestemäisistä näytteistä sekä tutkia yhden menetelmän soveltumista virtsanäytteiden tutkimiseen. Tavoitteena oli kehittää menetelmä, jolla voitaisiin todeta vähintään bakteeripitoisuus 10[3] - 10[4] PMY/ml virtsanäytteestä. Kirjallisuusosassa on tarkasteltu erilaisia pikamenetelmiä bakteerien toteamiseksi virtsanäytteistä sekä muista nestemäisistä näytteistä. Suurin osa virtsan bakteeripitoisuuden tutkimiseen tarkoitetuista menetelmistä perustuu joko erilaisiin entsymaattisiin reaktioihin tai bakteerien värjäykseen. Tutkimusosassa tutkittiin bakteerien värjäykseen perustuvan menetelmän soveltumista bakteerien toteamiseen virtsanäytteestä sekä bakteerien Gram-erotteluun. Tutkittavassa menetelmässä virtsanäyte suodatettiin ja suodattimelle jääneet bakteerit värjättiin. Tarkoituksena oli lisäksi poistaa väri spesifisesti Gram-negatiivisista bakteereista. Työssä etsittiin aluksi sopivaa suodatinmateriaalia, joka ei sitonut väriä. Lisäksi tutkittiin bakteerien esikäsittelyn vaikutusta värjäytymiseen. Erityisesti tarkasteltiin pH:n, detergentin ja kelaatin vaikutusta. Värjäyksessä käytettiin kationista toluidiinisinistä. Värin poistoa Gram-negatiivisista bakteereista kokeiltiin etanolin, asetonin ja etikkahapon avulla. Menetelmään soveltui positiivisesti varautunut suodatin, jolloin kationinen väri ei sitoutunut siihen ja ainoastaan bakteerit värjäytyivät. Kelaatti ja detergentti tehostivat bakteerien värjäytymistä merkittävästi. Menetelmä toimi parhaiten neutraalissa pH:ssa, jolloin taustaväriä ei esiintynyt. Väriä ei saatu poistettua spesifisesti Gram-negatiivisista bakteereista, joten menetelmällä saatiin määritettyä ainoastaan kokonaisbakteerimäärä. Värin voimakkuus oli verrannollinen bakteeripitoisuuteen. Menetelmä soveltui hyvin virtsanäytteille, kunhan näyte esisuodatettiin ennen varsinaista suodatusta. Esisuodatuksella poistettiin virtsan häiritseviä tekijöitä, jotka aiheuttivat taustaväriä. Menetelmällä voitiin todeta bakteeripitoisuus 10[6] PMY/ml, kun näytetilavuus oli 1 ml. Suuremmilla näytetilavuuksilla herkkyys kuitenkin parani ja näytemäärällä 10 - 20 ml voitiin todeta jo 10[5] PMY/ml.
  • Developing Multiplex Real-Time Quantitative PCR Assay for Diagnosis of Major Mastitis Pathogens
    (2008) Niskala, Silke
     Helsinki University of Technology | Master's thesis
    PCR pohjaisten menetelmien käyttö utaretulehduspatogeenien diagnostiikassa sekä nopeuttaa, että lisää herkkyyttä ja luotettavuutta verrattuna perinteisiin viljelymenetelmiin. Tämän työn tarkoituksena oli kehittää reaaliaikaiseen kvantitatiiviseen PCR menetelmään perustuva multipleksi-PCR analyysimenetelmä tärkeimpien utaretulehdus- eli mastiittipatogeenien sekä beta-laktamaasia koodaavan antibiootiresistenssigeenin tunnistamiseksi. Työn kirjallisuusosassa tarkasteltiin eri mastiittia aiheuttavia mikrobeja, niiden esiintyvyyttä, mastiitin hoitomenetelmiä sekä sairauden taloudellisia vaikutuksia. Näiden ohella käsiteltiin erilaisia utaretulehduspatogeenien diagnosointiin käytettyjä menetelmiä. Kokeellisessa osiossa esiteltiin multipleksi menetelmän kehitysprosessi. Reaaliaikaisessa kvantitatiivisessa multipleksi-PCR menetelmässä samassa PCR reaktiossa monistetaan useita eri kohdesekvenssejä, ja reaktioiden etenemistä voidaan seurata reaaliajassa. Tässä työssä valittiin samassa PCR reaktiossa tunnistettaviksi patogeeneiksi ensimmäiseen multipleksiin Staphylococcus aureus, Corynebacterium bovis ja Enterokokit sekä toiseen multipleksiin Stafylokokit, Streptococcus uberis ja Streptococcus agalactiae. Kolmanteen multipleksiin valittiin beta-laktamaasi geeni, Streptococcus dysgalactiae ja Escherichia coli, ja neljänteen Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Arcanobacterium pyogenes, Peptostreptococcus indolicus ja Serratia marcescens. Lisäksi työhön sisältyi PCR reaktiokomponenttien pitoisuuden optimointia ja PCR protokollan optimointia. Polymeraasientsyymin pitoisuuden nostamisen huomattiin vaikuttavan suotuisasti multipleksi PCR reaktioihin. PCR protokollan optimoinnissa keskityttiin denaturaatioajan ja yhdistetyn alukkeiden hybridisaatio- ja ekstensioajan optimointiin. Sopivaksi denaturaatioajaksi pääteltiin 15 s ja liittymis- ja ekstensioajaksi 60 s. Menetelmän kehittäminen onnistui odotusten mukaisesti. Haluttujen kohdesekvenssien monistaminen samassa PCR reaktiossa toimi hyvin ja testit mastiittimaitonäytteillä osoittivat tulosten olevan samankaltaisia sekä kehitetyllä multipleksi menetelmällä, että aiemmin käytetyllä tavanomaisella reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR menetelmällä.
  • Partikkeliperusteisen menetelmän kehittäminen albumiinin määrittämiseksi virtsasta
    (2005) Kanto, Laura
     Helsinki University of Technology | Master's thesis