Browsing by Author "Ahlfors, Sonja"

Now showing 1 - 1 of 1
  • No Thumbnail Available
    Item
    Utilization of PHI6 P2 polymerase in the production of double-stranded RNA
    (2006) Ahlfors, Sonja; Tieaho, Ville; Kemian tekniikan osasto; Teknillinen korkeakoulu; Helsinki University of Technology; Nordström, Katrina
    Työn kirjallisuusosassa on esitetty RNAi-vasteen vaiheet sekä eri tuotantotapoja RNAi-vasteen nostaville siRNA-molekyyleille. Kirjallisuusosassa on pohdittu tuotantotapojen hyötyjä ja ongelmia, sekä potentiaalisia sovelluksia siRNA-molekyyleille. Lisäksi kirjallisuusosassa on esitetty kokeellisessa osassa käytetyt RNA-polymeraasit (T7 RNA- ja FII6 P2-polymeraasi). Diplomityön kokeellisen osan tavoitteena oli kehittää menetelmä jonka avulla voidaan tuottaa RNAi-kokeisiin soveltuvaa kaksijuosteista RNA:ta (dsRNA). Kokeellinen osa aloitettiin määrittämällä P2-polymeraasin optimaaliset reaktio-olosuhteet tiettyjen puskurikomponenttien suhteen, sekä tutkimalla polymeraasin promoottori- ja templaattivaatimuksia. Promoottorikokeista kävi ilmi, että polymeraasi on parhaiten hyödynnettävissä pitkää promoottorisekvenssiä käytettäessä. Templaattikokeista nähtiin, että P2-polymeraasi pystyy transkriptoimaan hyvin vaihtelevan kokoisia denaturoituja DNA-templaatteja. Transkriptioreaktiolla tuotetun kaksijuosteisen RNA:n saanto jäi kuitenkin alle odotusten. Syy reaktion loppumiselle jäi selvittämättä, vaikka reaktio-olosuhteiden muuttumista ja entsyymin inaktivoitumista tutkittiin. Seuraavassa vaiheessa hyödynnettiin P2-polymeraasin replikaatioaktiivisuutta siten, että T7 RNA -polymeraasi transkriptoi yksijuosteista RNA:ta jonka P2-polymeraasi replikoi kaksijuosteiseksi. Tässä osuudessa tutkittiin tarkemmin molempien entsyymien reaktio-olosuhteita. RNA-polymeraasien yhteisreaktiolle pystyttiin kehittämään yhteinen reaktiopuskuri, joka ylläpiti molempien entsyymien aktiivisuutta, vaikka alustavissa kokeissa näytti siltä, että kaksi reaktiokomponenttia (mangaani ja spermidiini) saattaisivat muodostua ongelmaksi. Reaktion saantoa saatiin lisäksi huomattavasti parannettua käyttämällä korkeampaa nukleotidikonsentraatiota sekä lisäämällä reaktioon DNA-templaattia sekä T7 RNA -polymeraasia. Lopuksi tehtiin vertailukokeita kolmella (900 bp, 650 bp ja 20 kb) templaatilla. Kokeissa verrattiin kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti kehitetyllä menetelmällä tuotettua dsRNA:ta reaktioon, jossa dsRNA oli tuotettu T7 RNA -polymeraasin avulla. Vertailukokeista nähtiin selvästi, että kehitetyllä menetelmällä syntyi huomattavasti vähemmän epäspesifisiä tuotteita verrattaessa T7 RNA -polymeraasin reaktioon. RNA-polymeraasien yhteisreaktiossa oli hieman enemmän replikoimatta jäänyttä yksijuosteista RNA:ta, mutta tästä huolimatta kaksijuosteisen tuotteen saanto oli melko sama molemmilla menetelmillä. Suurella templaatilla (20 kb) tehdyllä kokeella ilmeni, että kehitetyllä menetelmällä on mahdollista tuottaa hyvin suurta kaksijuosteista RNA:ta, jonka tuottaminen ei ole mahdollista vertailumenetelmällä.